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yeruge

新虫 (小有名气)


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去磷酸化酶
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对载体进行双酶切,需要去磷酸化吗?如果要,去磷酸化酶是在酶切反应之后加,还是酶切片段割胶纯化后再加?

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yeruge

新虫 (小有名气)


引用回帖:
22楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-03 19:44:19
首先对于高质量的连接效率,对载体进行去磷酸化是需要的(双酶切处理好了,影响不大,但是为了避免双酶切体系一些载体酶切不完全,仍处于单酶切的形态,接下来同样会可能自连出现空载。如果是单酶切,按照常规操作 ...

我要跑电泳割胶回收的,就算载体自连,应该也没事吧?我双酶切三小时

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23楼2016-03-03 20:30:13
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12楼2016-03-03 18:55:49
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原海亮

木虫 (著名写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
双酶切是否需要去磷酸化,取决于你构建克隆的目的,如果一般克隆的话,只要保证酶切充分些,获得正确克隆概率还是可以的,如果构建文库之类的,最好有去磷酸化处理,保证文库中克隆的连接效率。去磷酸化我们同常在回收获得载体片段后再进行的。PS.虽然我进来已经没有金币了

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13楼2016-03-03 19:01:39
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lifechuteng

新虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
双酶切不需要去磷酸化的,因为两个酶切位点粘性末端应该不同,在酶切完全的前提下,不会发生载体自连。
并且,载体去磷酸化之后,会影响后续的连接效率。
最后,鄙视那些只领红包不帮忙的人……

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14楼2016-03-03 19:02:31
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rnydufe2楼
2016-03-03 18:55   回复  
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2016-03-03 18:55   回复  
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beverish4楼
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wht123zzy5楼
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longwave7楼
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sdp_sqf10楼
2016-03-03 18:55   回复  
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zbwlll11楼
2016-03-03 18:55   回复  
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