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yeruge

新虫 (小有名气)


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去磷酸化酶
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对载体进行双酶切,需要去磷酸化吗?如果要,去磷酸化酶是在酶切反应之后加,还是酶切片段割胶纯化后再加?

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yeruge

新虫 (小有名气)


引用回帖:
24楼: Originally posted by 原海亮 at 2016-03-03 21:26:13
我的意思是,双酶切不进行磷酸化,一般是可以满足你的实验要求的!当然你这里说的切胶回收,和能不能避免自连是没有关系的,打个比方即使你切胶回收,如果酶切不完全,回收的片段里同样会有双酶切的载体和单酶切的 ...

后续实验载体自连,就会出现假阳性?

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25楼2016-03-03 22:56:26
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longwave

木虫之王 (文学泰斗)


12楼2016-03-03 18:55:49
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原海亮

木虫 (著名写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
双酶切是否需要去磷酸化,取决于你构建克隆的目的,如果一般克隆的话,只要保证酶切充分些,获得正确克隆概率还是可以的,如果构建文库之类的,最好有去磷酸化处理,保证文库中克隆的连接效率。去磷酸化我们同常在回收获得载体片段后再进行的。PS.虽然我进来已经没有金币了

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13楼2016-03-03 19:01:39
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lifechuteng

新虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
双酶切不需要去磷酸化的,因为两个酶切位点粘性末端应该不同,在酶切完全的前提下,不会发生载体自连。
并且,载体去磷酸化之后,会影响后续的连接效率。
最后,鄙视那些只领红包不帮忙的人……

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14楼2016-03-03 19:02:31
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rnydufe2楼
2016-03-03 18:55   回复  
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2016-03-03 18:55   回复  
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beverish4楼
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wht123zzy5楼
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longwave7楼
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sdp_sqf10楼
2016-03-03 18:55   回复  
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zbwlll11楼
2016-03-03 18:55   回复  
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