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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 去磷酸化酶
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yeruge

新虫 (小有名气)
已领完
去磷酸化酶
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对载体进行双酶切，需要去磷酸化吗？如果要，去磷酸化酶是在酶切反应之后加，还是酶切片段割胶纯化后再加？

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1楼 2016-03-03 18:55:18
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lifechuteng

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by yeruge at 2016-03-03 19:06:00
谢谢，我就是一直连接不上
...

不需要去磷酸化，因为连接中要用到载体上的磷酸基团，你去掉之后，引物上的羟基就无法连到磷酸基团上啦~
用普通的引物进行PCR ,产物的5‘端和3’端都是羟基的，载体切开后的磷酸基团是它们连接的唯一希望……

但最好双酶切后跑电泳胶回收一下，将载体上切下的小片段分离出去~
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17楼2016-03-03 19:11:56
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longwave

木虫之王 (文学泰斗)
谢谢

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12楼2016-03-03 18:55:49
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原海亮

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
双酶切是否需要去磷酸化，取决于你构建克隆的目的，如果一般克隆的话，只要保证酶切充分些，获得正确克隆概率还是可以的，如果构建文库之类的，最好有去磷酸化处理，保证文库中克隆的连接效率。去磷酸化我们同常在回收获得载体片段后再进行的。PS.虽然我进来已经没有金币了

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yeruge
13楼2016-03-03 19:01:39
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lifechuteng

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
双酶切不需要去磷酸化的，因为两个酶切位点粘性末端应该不同，在酶切完全的前提下，不会发生载体自连。
并且，载体去磷酸化之后，会影响后续的连接效率。
最后，鄙视那些只领红包不帮忙的人……
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yeruge
14楼2016-03-03 19:02:31
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rnydufe2楼
2016-03-03 18:55   回复  
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11766639833楼
2016-03-03 18:55   回复  
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beverish4楼
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wht123zzy5楼
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187659257766楼
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longwave7楼
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W菜鸟驿站T8楼
2016-03-03 18:55   回复  
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金黄球菌t9楼
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sdp_sqf10楼
2016-03-03 18:55   回复  
yeruge(金币+4): 谢谢参与
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zbwlll11楼
2016-03-03 18:55   回复  
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