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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 逆向构建空载体
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李小冬

金虫 (小有名气)

[求助] 逆向构建空载体

我购买了一个构建好的真核表达质粒，想把这个质粒做成没有目的片段的质粒，用于阴性对照。请各位赐教！
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哎呀呀
1楼 2013-12-03 12:22:24
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gyesang

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个是非常容易的，设计一对引物，把载体序列PCR出来，引物上带一个相同酶切位点，酶切连接转化
即可

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2013-12-03 12:59:22
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李小冬

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-03 12:59:22
这个是非常容易的，设计一对引物，把载体序列PCR出来，引物上带一个相同酶切位点，酶切连接转化
即可

载体6000多个碱基，是否会发生错配啊，需要什么样的酶呢 ？
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哎呀呀
3楼2013-12-03 15:03:43
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gyesang

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3楼: Originally posted by 李小冬 at 2013-12-03 15:03:43
载体6000多个碱基，是否会发生错配啊，需要什么样的酶呢 ？...

高保真酶，比如KOD和pfu就可以满足要求
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4楼2013-12-03 20:21:40
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李小冬

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2013-12-03 20:21:40
高保真酶，比如KOD和pfu就可以满足要求...

再弱弱的问问，我设计引物的时候，5‘端应该是我想要的限制性内切酶的序列，这个是不不可以加保护碱基?
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哎呀呀
5楼2013-12-04 13:01:59
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
李小冬: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-12-04 21:33:13
引用回帖:
5楼: Originally posted by 李小冬 at 2013-12-04 13:01:59
再弱弱的问问，我设计引物的时候，5‘端应该是我想要的限制性内切酶的序列，这个是不不可以加保护碱基?...

要加保护碱基，最好要酶切后，回收做连接，转化
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6楼2013-12-04 14:09:21
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