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caaslc

金虫 (小有名气)

[求助] 跪求,,单链退火形成双链的步骤

我有两条长度为106bp的互补单链DNA序列,请教各位大虾,怎样将其退火形成双链DNA呀,求具体步骤。
Tm=78.08             78.47
%GC=50               50.94
需要把这两条链配制成多大浓度呀?越详细越好啊!拜谢了!
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对科研的评价,我用两个字概括:呵呵
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
caaslc: 金币+2, 有帮助 2013-11-07 16:55:17
以下两种都是成功的做法
第一种做法:取两单链互补DNA各1ul(100uM),加入48ddH2O,于EP管中,然后于沸水中煮5min,然后EP管连同沸水一起慢慢冷却至室温

第二种做法:溶于任一种buffer中,变性冷却,buffer可以为酶切buffer,PCRbuffer
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2楼2013-11-06 13:01:59
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liangdouxion

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
caaslc: 金币+1, 有帮助 2013-11-07 16:55:29
http://www.beyotime.com/annealing-buf-dna.htm
请看这个 希望对你有用 我们实验室就是这么做的。
毛球
6楼2013-11-06 16:29:57
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普通回帖

caaslc

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-06 13:01:59
以下两种都是成功的做法
第一种做法:取两单链互补DNA各1ul(100uM),加入48ddH2O,于EP管中,然后于沸水中煮5min,然后EP管连同沸水一起慢慢冷却至室温

第二种做法:溶于任一种buffer中,变性冷却,buffer可以为 ...

你好,请问第一种方法不需要buffer吗,直接加入48ul 水,最后浓度会不会太低呀
对科研的评价,我用两个字概括:呵呵
3楼2013-11-06 15:10:02
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gyesang

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引用回帖:
3楼: Originally posted by caaslc at 2013-11-06 15:10:02
你好,请问第一种方法不需要buffer吗,直接加入48ul 水,最后浓度会不会太低呀...

对了,
我退火后双链是做连接的,不知道你的目的是什么?
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4楼2013-11-06 15:35:42
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caaslc

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-06 15:35:42
对了,
我退火后双链是做连接的,不知道你的目的是什么?...

我也是做链接,退火后两端会各有一个粘性末端,连到质粒上。
我还想请教一下,我的两条链是合成的,报告单上标注的是:此DNA5端、3端均为羟基。我在做连接之前是不是要加磷酸基团之类的工作,小弟刚接触这方面实验,还望大侠不吝赐教!
对科研的评价,我用两个字概括:呵呵
5楼2013-11-06 16:28:45
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gyesang

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【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by caaslc at 2013-11-06 16:28:45
我也是做链接,退火后两端会各有一个粘性末端,连到质粒上。
我还想请教一下,我的两条链是合成的,报告单上标注的是:此DNA5端、3端均为羟基。我在做连接之前是不是要加磷酸基团之类的工作,小弟刚接触这方面实验 ...

退火双链不需要加磷酸基团,直接连
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7楼2013-11-06 16:45:57
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caaslc

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by liangdouxion at 2013-11-06 16:29:57
http://www.beyotime.com/annealing-buf-dna.htm
请看这个 希望对你有用 我们实验室就是这么做的。

很有帮助啊,thank  you!
对科研的评价,我用两个字概括:呵呵
8楼2013-11-06 17:45:10
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caaslc

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by gyesang at 2013-11-06 16:45:57
退火双链不需要加磷酸基团,直接连...

我还想确认下,各1微升会不会浓度太低呀。我看好多都要10微升。谢谢啦!
对科研的评价,我用两个字概括:呵呵
9楼2013-11-06 17:48:18
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gyesang

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引用回帖:
9楼: Originally posted by caaslc at 2013-11-06 17:48:18
我还想确认下,各1微升会不会浓度太低呀。我看好多都要10微升。谢谢啦!...

我说的浓度是100uM 的DNA加1ul
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10楼2013-11-06 19:41:10
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