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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » ELISA TMB显色液怎么配制？我配的怎么一混合就浑浊了？
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jianglay

新虫 (初入文坛)

[求助] ELISA TMB显色液怎么配制？我配的怎么一混合就浑浊了？ 已有2人参与

按以下配方配制了TMB显色液：
A液：将TMB粉溶于DMSO中使终浓度为11mg/ml，再加入1/10体积的甘油（全部避光操作，然后装入黑瓶避光4度保存）
B液：pH5.5   0.2 mol／L磷酸氢二钠与0.1 moL／L柠檬酸缓冲液配制过氧化脲素浓度为0.74 mg／mL的溶液。
使用时用B将A稀释50倍混合使用，但是问题来了一混合就出现了絮状沉淀，而且显色比较淡
跪求指点~~谢谢~
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喔列打击哇刚大木达
1楼 2011-07-14 14:25:28
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xbingfeng

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+5, EPI+1): 鼓励应助 2011-07-14 20:30:39
jianglay(金币+1): 这些方法我都有，按你推荐的方法一定容就浑浊了，有东西析出 2011-07-18 19:10:47
这个配方不好。推荐你用这个配方：B液配的时候要充分搅拌，大约三四个小时，避光。
底物显色液A液：
醋酸钠 13.6g
柠檬酸 1.6g
H2O2（30%） 0.3ml
dH2O 至500ml

底物显色液B液（避光保存）：
EDTA-Na 0.2g
柠檬酸 0.95g
甘油 50ml
TMB(四甲基联苯胺) （用DMSO溶解为10mg/ml后在加） 0.2g
dH2O 至 500ml

如果这个配方还不好，你可以试试下列配方：
1 。称取TMB １７．２mg(固体），加ＤＭＳＯ１ml 溶解　，然后加醋酸钠缓冲液（０．１ｍｏｌ／ｌ，ｐＨ５．５）６６ ml，此为底物A
底物B ,取双蒸水100ml，加３０％H2O2　１７微升
使用时A：B 液等体积混匀即可．

称取TMB 20mg(固体），先用无水乙醇10ml 溶解，充分振荡（试剂瓶要干净，干燥），加双蒸水定容到100 ml，此为底物A
底物B ,取1水柠檬酸 2.1g，无水Na2HPO4 2.82g，0.75%的过氧化氢尿素 0.64ml，双蒸水定容至100ml(无须调PH值，应在4.5-5.0范围。
使用时A：B 各取5ml 混匀，可用于一块96孔板显色。
过氧化氢脲比H2O2稳定，不必如H2O2现用现配，都起供氢体的作用。

2
TMB(10mg/5m无水l乙醇) 0.5ml
底物缓冲液 10ml
0.75%过氧化氢 32ul
这样的配方已经很好,为什么要用尿素?
底物缓冲液 :
0.2M磷酸氢二钠 25.7ml
0.1M柠檬酸 24.3ml
加蒸馏水 50ml

TMB使用液：
TMB （10mg/5ml，无水乙醇）0.5ml
底物缓冲液 10ml
0.75% H2O2 32 Ul

3.
TMB加入2.5ml无水酒精中,可加热至37℃～40℃直到TMB完全溶解。
将TMB配成1%浓度，4 ℃ 保存半年以内使用。
使用前，用pH5.0磷酸—柠檬酸底物液9.9ml加入0.1ml（1mgTMB）1%TMB液，再按每毫升TMB加入30% H2O21ul混匀后立即使用。
2NH2SO4终止后，450nm测定OD值。

4.
HRP的底物：
A液：0.02%H2O2 ；用0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠，PH4.5～5.0稀释。
B液：TMB-HCl：0.4‰；用50mM柠檬酸钠，浓HCl调PH值为2.8的溶液溶解。
A液，B液各50ul使用。可使用起来显色比较缓慢，OD值较PIERCE的底物稍偏低一点。
请指教 1. 是否有更好的改善；

5.

1、TMB粉末，溶于N，N－二甲基甲酰胺，配成10mg/mL。
2、底物缓冲液：0.2Mol/LNa2HPO4 25.7mL
0.1Mol/L柠檬酸 24.3mL
水 50mL
3、H2O2
用时 10mg/mL TMB 165uL
底物缓冲液 11mL
H2O2 3.3uL
酶标板中 每孔加100Ul。

6.

1.底物液A：TMB200mg，无水乙醇（或DMSO）100ml,加双蒸水至1000ml。
2.底物B缓冲液（0.1ml/L柠檬酸-0.2ml/L磷酸氢二纳，pH5.0-5.4）:
Na2HPO4 14.60g，柠檬酸9.33g，0.75%过氧化氢尿素6.4ml，加三蒸水至
1000ml，调至pH5.0-5.4
3.将底物液A和底物B按1：1混合即成TMB-过氧化氢尿素应用液。
这种方法简单、方便、节约试剂，同时过氧化氢尿素较过氧化氢稳定，更
能够确保准确性，荐议大家与我共同分享。哦，但是还有一点要注意，一
次不要配太多，A液久置易变色。

7.

Substrate 'Stock' Solution
·  58mg Tetramethylbenzidine (TM
·  5ml DMSO
·  Dissolve TMB in DMSO - wear gloves, and use fume cupboard.
·  Cover container in tin foil, label as 'toxic'.
·  Store at room temperature in toxic cupboard for up to 1 month.
Substrate 'Working' Solution
·  100ml of TMB stock solution per 10ml of substrate buffer.
·  10ml of H2O2 per 10ml of substrate buffer.

8.

1,称取3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）0.08g，加40ml二甲亚砜溶解，加60ml甲醇，混匀，加100ml底物缓冲液在暗处搅拌2小时至溶解，室温静置4小时。
2,取50μL TMB(10 mg TMB溶于1mL二甲基甲酰胺中)溶液+10 mL底物缓冲 液+10μL30%过氧化氢，混均。



  9.

底物液
底物：(TMB-H2O2溶液) pH 5.5
底物缓冲液(PH5.0，0.1M 柠檬酸-0.2M Na２HPO４·12H2O):
1.84g Na２HPO４.12H2O和0.47g 柠檬酸，加水到100ml，调节pH值5.0-5.4
或 9.2g Na２HPO４.12H2O和2.35g 柠檬酸，加水到500ml，调节pH值5.0-5.4

50ml 0.75% H２O２ :取30% H２O２ 1.25ml,总体积调整为50ml.
TMB(四甲基联苯胺)使用液:　取200mg TMB溶解于100ml无水乙醇中。-20℃保存。

临用时配：
TMB(2mg／ml无水乙醇) 0.5ml
　　　　 底物缓冲液(PH5.5)　　　 9.5ml
　　　　 0.75％H２O２　　 42ul
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4楼2011-07-14 18:53:14
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普通回帖

jianglay

新虫 (初入文坛)
没人？自顶
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喔列打击哇刚大木达
2楼2011-07-14 15:12:03
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jianglay

新虫 (初入文坛)
没人啊啊！！！
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喔列打击哇刚大木达
3楼2011-07-14 18:21:18
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jianglay

新虫 (初入文坛)
这几个我都有，没怎么好
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喔列打击哇刚大木达
5楼2011-07-14 19:23:12
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liuyuncun

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 感谢交流 2011-07-15 12:33:29
jianglay(金币+2): 按你的方法做颜色很淡啊 2011-07-18 19:12:11
给你个简单的吧  国标上的
1.底物溶液:取50μL TMB(10mgTMB溶于1mLDMSO中)溶液+10mL底物缓冲液
+10μL30%过氧化氢，混匀。
2. 底物缓冲液  pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液，配制方法为:
0.1mol/L柠檬酸C6H8O7•H2O)，即称取柠檬酸19.2g，加水至1000mL，为甲液;
0.2mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4),即称取磷酸氢二钠71.7g,加水至1000mL，为乙液;
取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即可
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学到老 活到老
6楼2011-07-15 07:58:14
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chshjia
7楼2011-07-15 10:17:45
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f_luckyboy
8楼2011-07-16 09:41:15
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liuyuncun

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

jianglay(金币+1): 打算重新买TMB再试一下了，10mg溶于1ml DMSO已经算很多了 2011-07-21 23:24:47
你按照我说的配制方法做过了吗？如果颜色浅的话你可以加大TMB的量，我说的是取50μL TMB(10mgTMB溶于1mLDMSO中)，你可以加大到200或500μL 试试 祝实验顺利
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学到老 活到老
9楼2011-07-21 21:30:56
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liuyuncun

金虫 (小有名气)
对了  你说你的颜色浅 OD值大约在多少啊？可以把你的其他试剂的稀释比说一下吗？也可能不是底物的原因啊？你用ELISA什么模式测什么东西呢？
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学到老 活到老
10楼2011-07-21 21:34:10
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