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利用高保真酶克隆基因没有加尾怎么办 已有5人参与
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刚开始做基因克隆，利用的高保真酶（takara Prime STAR），pcr完后直接切胶纯化后连接了，到最后发现效率特别低才听说要加尾，可现在的回收产物该如何利用呢？ 目前，问了人总结出三种：一是以回收产物为模板，用rtaq酶加尾，但回收产物用量得14.5，做过一次可能跟产物浓度有关，成功率50%，二是以回收产物为模板，继续用STAR酶，用量几微升就可以，然后再用rtaq延伸，三是几微升的用量，直接用rtaq酶跑pcr。 我实在是拿不准该怎么办，求大神指点迷津！（产物浓度大部分6左右，4、5个30左右，还有一些只有2、3）如果可以，提供个参考体系最感激不过！●﹏● 发自小木虫Android客户端 |
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hanxiaominhu
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2楼2016-02-21 18:34:24
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PCR结束后，往反应体系中加入rtaq和buffer，72度充分延伸半个小时就行 发自小木虫Android客户端 |
3楼2016-02-21 19:42:16
kangaroo0513
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【答案】应助回帖
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1、你问人的3种答案，只有1比较靠谱，其他两种都别试，2和3那是增加突变概率。我试过PCR产物切胶回收后，再用普通的taq在buf和dNTP里72度30min，然后再回收，再连普通的T。这个办法看人品的，人品好的时候杠杠滴，人品差的时候就完蛋了。。并且两次回收，浓度会低。。。 2、由于后来我rp一直不好，就换了Thermo家的平末端连接试剂盒，发现虽然效率不太高，但是每次都有那么10来个菌，阳性率蛮高的。。也就是说，只要你不是建库，就可以用这个办法，省时省钱省力（由于自己也要用，我做了大量的平端载体，需要的话站短我吧！自连自杀型哦，只有连进去插入片段的才能活下来）。 3、使用无缝克隆试剂盒，直接把平端PCR产物克隆至目的载体上就完事。。这个最快，但是引物要重新设计。 如果是小白的话，推荐第二种，先从廉价简单的来尝试，这样经验值会up。。以后解决问题的能力也跟着up了，再逐渐慢慢玩高级货。。 加油！！ |
5楼2016-02-22 00:42:55
匿名
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6楼2016-02-22 09:11:42
jackyoung
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二楼的平端克隆很靠谱，如果非要T-载体，可以直接拿回收产物加Taq和dNTPs 72度20分钟，不用回收直接连接。我们一般都是在PS酶括增体系的最后加入Taq，在72度孵育10分钟，然后切胶回收连接。 发自小木虫Android客户端 |
11楼2016-02-22 23:46:00
水杯小一
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VecScreen: Screen for Vector Contamination http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/ 还是去下载体再比对，这样容易看出问题。去载体如果没找到你的序列的话，实验要重新开始。如果是部分转入的话，还可以拿以前的菌再P一下，试试运气。 |
21楼2016-03-08 17:11:29
Ljch1121
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kangaroo0513
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