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蕨类森林

新虫 (小有名气)

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[求助] 利用高保真酶克隆基因没有加尾怎么办已有5人参与

刚开始做基因克隆，利用的高保真酶（takara Prime STAR），pcr完后直接切胶纯化后连接了，到最后发现效率特别低才听说要加尾，可现在的回收产物该如何利用呢？
目前，问了人总结出三种：一是以回收产物为模板，用rtaq酶加尾，但回收产物用量得14.5，做过一次可能跟产物浓度有关，成功率50%，二是以回收产物为模板，继续用STAR酶，用量几微升就可以，然后再用rtaq延伸，三是几微升的用量，直接用rtaq酶跑pcr。
我实在是拿不准该怎么办，求大神指点迷津！（产物浓度大部分6左右，4、5个30左右，还有一些只有2、3）如果可以，提供个参考体系最感激不过！●﹏●

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1楼 2016-02-21 16:45:40

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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

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引用回帖:

8楼: Originally posted by 蕨类森林 at 2016-02-22 22:14:34
谢谢，因为我刚开始做，不好意思就买其他试剂，我就用1这个方法加了A，准备连接，用的takara PMD-18-T，solution I ，我看说明书16℃半个小时就可以，实验室一般是16℃ 3-4h，还有16℃过夜，4℃过夜的，哪种效率比 ...

solution1的话，4度过夜。我之前也在用。我从来不用蓝白斑，所以不知道蓝白斑的事情，我都是菌液PCR或者抽质粒酶切鉴定的。