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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 利用高保真酶克隆基因没有加尾怎么办
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蕨类森林

新虫 (小有名气)

[求助] 利用高保真酶克隆基因没有加尾怎么办 已有5人参与

刚开始做基因克隆，利用的高保真酶（takara Prime STAR），pcr完后直接切胶纯化后连接了，到最后发现效率特别低才听说要加尾，可现在的回收产物该如何利用呢？
目前，问了人总结出三种：一是以回收产物为模板，用rtaq酶加尾，但回收产物用量得14.5，做过一次可能跟产物浓度有关，成功率50%，二是以回收产物为模板，继续用STAR酶，用量几微升就可以，然后再用rtaq延伸，三是几微升的用量，直接用rtaq酶跑pcr。
我实在是拿不准该怎么办，求大神指点迷津！（产物浓度大部分6左右，4、5个30左右，还有一些只有2、3）如果可以，提供个参考体系最感激不过！●﹏●

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1楼 2016-02-21 16:45:40
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Ljch1121

新虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-02-21 22:29:24
PCR结束后，往反应体系中加入rtaq和buffer，72度充分延伸半个小时就行

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3楼2016-02-21 19:42:16
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-02-21 22:28:38
为了效率，你可以直接买平末端链接的载体。Transgene就有。
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2楼2016-02-21 18:34:24
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Ljch1121

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by Ljch1121 at 2016-02-21 19:42:16
PCR结束后，往反应体系中加入rtaq和buffer，72度充分延伸半个小时就行

加入少量rtaq，或者PCR回收产物按rtaq酶的反应体系延伸半小时

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4楼2016-02-21 19:47:56
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2016-02-22 22:38:31
1、你问人的3种答案，只有1比较靠谱，其他两种都别试，2和3那是增加突变概率。我试过PCR产物切胶回收后，再用普通的taq在buf和dNTP里72度30min，然后再回收，再连普通的T。这个办法看人品的，人品好的时候杠杠滴，人品差的时候就完蛋了。。并且两次回收，浓度会低。。。

2、由于后来我rp一直不好，就换了Thermo家的平末端连接试剂盒，发现虽然效率不太高，但是每次都有那么10来个菌，阳性率蛮高的。。也就是说，只要你不是建库，就可以用这个办法，省时省钱省力（由于自己也要用，我做了大量的平端载体，需要的话站短我吧！自连自杀型哦，只有连进去插入片段的才能活下来）。

3、使用无缝克隆试剂盒，直接把平端PCR产物克隆至目的载体上就完事。。这个最快，但是引物要重新设计。

如果是小白的话，推荐第二种，先从廉价简单的来尝试，这样经验值会up。。以后解决问题的能力也跟着up了，再逐渐慢慢玩高级货。。

加油！！
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5楼2016-02-22 00:42:55
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