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jackyoung

新虫 (正式写手)

二楼的平端克隆很靠谱,如果非要T-载体,可以直接拿回收产物加Taq和dNTPs 72度20分钟,不用回收直接连接。我们一般都是在PS酶括增体系的最后加入Taq,在72度孵育10分钟,然后切胶回收连接。

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CestLaVie
11楼2016-02-22 23:46:00
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jackyoung

新虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2016-02-22 00:42:55
1、你问人的3种答案,只有1比较靠谱,其他两种都别试,2和3那是增加突变概率。我试过PCR产物切胶回收后,再用普通的taq在buf和dNTP里72度30min,然后再回收,再连普通的T。这个办法看人品的,人品好的时候杠杠滴,人 ...

我们用2-3屡试不爽,难道人品太好了,我们不加循环哪里增加的突变?

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CestLaVie
12楼2016-02-22 23:47:25
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sunlk

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
如果是做克隆的话,没必要操作这一步啊,直接用限制性内切酶切 直接连想要的载体。
很给力
13楼2016-02-23 08:22:04
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水杯小一

金虫 (小有名气)

直接在反应完的原体系里加2ul的rTaq,72℃反应5-10min,妥妥的
14楼2016-02-24 16:16:38
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蕨类森林

新虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by 水杯小一 at 2016-02-24 16:16:38
直接在反应完的原体系里加2ul的rTaq,72℃反应5-10min,妥妥的

嗯,我是切完胶了才发现没有加尾,所以用切胶产物加尾再连接的,测序结果回来后发现有接近一半明明菌落PCR条带大小差不多是对的,但序列却比对不上,这是什么原因呢?
15楼2016-03-04 19:03:41
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蕨类森林

新虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2016-02-22 22:58:29
solution1的话,4度过夜。我之前也在用。我从来不用蓝白斑,所以不知道蓝白斑的事情,我都是菌液PCR或者抽质粒酶切鉴定的。...

嗯,我也是蓝白斑之后挑菌落进行PCR验证然后送测序,但发现很多明明条带大小是对的,但测序结果却不对,这可能是什么原因呢?
16楼2016-03-04 19:07:08
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zjsuiyuan

新虫 (初入文坛)

Pcr跑完后,直接加入tag酶延伸10分钟左右就行!

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17楼2016-03-04 20:32:08
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匿名

用户注销 (著名写手)

本帖仅楼主可见
18楼2016-03-04 21:35:58
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水杯小一

金虫 (小有名气)

引用回帖:
15楼: Originally posted by 蕨类森林 at 2016-03-04 19:03:41
嗯,我是切完胶了才发现没有加尾,所以用切胶产物加尾再连接的,测序结果回来后发现有接近一半明明菌落PCR条带大小差不多是对的,但序列却比对不上,这是什么原因呢?...

测序结果去载体后反向互补得到的序列有没有比对
19楼2016-03-05 09:18:49
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蕨类森林

新虫 (小有名气)

引用回帖:
19楼: Originally posted by 水杯小一 at 2016-03-05 09:18:49
测序结果去载体后反向互补得到的序列有没有比对...

嗯  我有进行反向互补,但没有去载体,我看到你这么说就去搜了下怎么去载体,比较易懂的好像就在NCBI上进行,但我们这儿网速慢,又感觉比得上的就比得上,没去也行,但比不上的颠来倒去的都比不上呢~~所以就没去,如果只是没去载体这样影响大吗?
20楼2016-03-08 16:05:05
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