应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 假单胞菌 同源重组 插入突变 蔗糖筛选
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
81/1返回列表
查看: 1676  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

会飞的鱼622

新虫 (初入文坛)

[求助] 假单胞菌 同源重组 插入突变 蔗糖筛选 已有2人参与

各位大侠请求帮助
我做的是假单胞菌羧卞抗性的基因敲除试验，选用的自杀质粒是PJQ200sk  gent抗性，将基因的ATG上下游500-600bp片段扩增出来，在ATG下游20bp左右插入卡那霉素抗性基因，然后连入PJQ200sk   
1.进行三亲杂交，在卡那霉素和羧卞的平板上长斑，pcr验证能够检测到突变后基因大小的片段，但是扩增不出来假单胞菌其他的基因，蔗糖筛选后也一样
2.进行电转，在卡那霉素和羧卞的平板上长斑，菌液pcr目的基因和其他基因都扩增不到，能再蔗糖板上张，也能在gent抗性的培养基中张
各位大侠帮帮忙

发自小木虫Android客户端
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2016-02-15 00:05:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

岳大白

新虫 (初入文坛)
我和你做的差不多，目前是单交换进行的不顺利，也不知道什么原因

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
2楼2016-02-23 15:55:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

岳大白

新虫 (初入文坛)
你的三亲杂交是怎么做的，用没用到辅助质粒，能和我说说吗？

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
3楼2016-02-23 15:56:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

quiller2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-02-23 22:22:54
是杂菌吗？

1 是否有gen的抗性？
2 用单抗平板测试你的供体菌，受体菌和辅助菌确实能够用来筛选，而没有其它交叉的抗性
3 关于sacB的问题，在假单胞菌中本来就用的不大好，反正我们的是这样
4 三亲本后，挑取的单菌落多划线几次，然后用蔗糖筛选也是多划线几次--- ---别染杂菌了
5 主要看pcr的结果吧  sacB不是太好用，或者你的基因是条件致死了，长出来的都是突变了的，那就搞不定了
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

会飞的鱼622
致良知
4楼2016-02-23 19:00:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

会飞的鱼622

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by quiller2000 at 2016-02-23 19:00:41
是杂菌吗？

1 是否有gen的抗性？
2 用单抗平板测试你的供体菌，受体菌和辅助菌确实能够用来筛选，而没有其它交叉的抗性
3 关于sacB的问题，在假单胞菌中本来就用的不大好，反正我们的是这样
4 三亲本后，挑取 ...

是说我的双抗筛选后获得的单克隆是否有gent抗性是吗？
我的电转化后得到的转化子是有gent抗性的，三亲结合没试过是否有gent抗性
我做的基因不是致死基因
抗生素交叉抗性的问题，我试过辅助菌和供体菌两种菌不抗羧卞，受体菌不抗kana
麻烦帮我在分析一下可能还是哪些方面的问题

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
5楼2016-02-26 19:06:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

会飞的鱼622

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 岳大白 at 2016-02-23 15:56:24
你的三亲杂交是怎么做的，用没用到辅助质粒，能和我说说吗？

用辅助菌helper菌株

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
6楼2016-02-26 19:07:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

su2008su11

木虫 (正式写手)
想咨询一下，您将构建的片段，连接进自杀质粒的时候，用的是哪家公司的T4连接酶？是宝生物（TAKARA）吗？
赞一下 回复此楼
一命二运三风水四积阴德五读书
7楼2016-12-07 01:11:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

远丽123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你好 我的问题和你的一模一样，我也是假单胞菌，我用的自杀质粒是pEX18GM,辅助菌是pRK600,我也是三亲后涂平板验证是对的（用敲出基因的1和4引物以及其他基因的引物都是有的，说明是单交换成功的菌），但是我再次挑目的菌在LB平板上划线时，就一点也长不出来了，偶尔会有一点点的菌长出来，但是用假单胞菌的其他基因来扩就扩不出，而且蔗糖后用敲除的1和4 引物验证还是对的，但是假单胞菌的其他基因还是没有，我就把蔗糖后的菌拿去测序，发现是大肠杆菌。我的猜测是单交换的假单胞菌死掉了（不明白为什么死掉，抗生素的选择是合适的），在LB上长出来的一点点的菌就是供体菌。但是为什么会这样我就不明白了，这一步也是卡了很久了，请问你后来问题解决了吗？？能否告知如何解决的，万分感谢！！
赞一下 回复此楼
8楼2017-12-28 15:59:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 会飞的鱼622 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 考研调剂 +7 小蜡新笔 2026-03-29 7/350 2026-03-29 19:00 by 学员8dgXkO
[考研] 08工科求调剂286 +3 tgs_001 2026-03-28 3/150 2026-03-29 18:29 by 1018329917
[考研] 289求调剂 +5 BrightLL 2026-03-29 5/250 2026-03-29 17:24 by zhyzzh
[考研] 一志愿南昌大学324求调剂 +5 hanamiko 2026-03-29 5/250 2026-03-29 16:46 by 学员8dgXkO
[考研] 340求调剂 +6 Amber00 2026-03-26 6/300 2026-03-29 12:06 by 无际的草原
[考研] 一志愿厦门大学化学学硕307求调剂 +10 y7czhao 2026-03-26 10/500 2026-03-28 14:23 by 唐沐儿
[考研] 求调剂 +6 芦lty 2026-03-25 7/350 2026-03-28 13:13 by 唐沐儿
[考研] 求调剂推荐 材料 304 +15 荷包蛋hyj 2026-03-26 15/750 2026-03-28 04:13 by fmesaito
[考研] 322求调剂 +4 我真的很想学习 2026-03-23 4/200 2026-03-27 13:51 by 杨杨杨紫
[考研] 298调剂 +3 jiyingjie123 2026-03-27 3/150 2026-03-27 11:57 by wxiongid
[考研] 314求调剂 +3 溪云珂 2026-03-26 3/150 2026-03-27 11:20 by sanrepian
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +4 崔wj 2026-03-26 4/200 2026-03-27 08:04 by chemisry
[考研] 求调剂 一志愿 本科 北科大 化学 343 +6 13831862839 2026-03-24 7/350 2026-03-26 22:57 by 不吃魚的貓
[考研] 085602化学工程求调剂。 +4 平乐乐乐 2026-03-26 4/200 2026-03-26 17:57 by fmesaito
[考研] 一志愿南航 335分 | 0856材料化工 | GPA 4.07 | 有科研经历 +6 cccchenso 2026-03-23 6/300 2026-03-25 22:25 by 544594351
[考研] 材料与化工304求B区调剂 +3 邱gl 2026-03-25 3/150 2026-03-25 19:03 by Ainin_
[考研] 调剂 +4 13853210211 2026-03-24 4/200 2026-03-24 19:44 by ms629
[考研] 一志愿北化315 求调剂 +3 akrrain 2026-03-24 3/150 2026-03-24 19:35 by 了了了了。。
[考研] 085404电子信息284分求调剂 +4 13659058978 2026-03-24 4/200 2026-03-24 12:15 by syl20081243
[考研] 材料/农业专业，07/08开头均可，过线就行 +3 呵唔哦豁 2026-03-23 4/200 2026-03-23 22:30 by 汪！？！
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭