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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 假单胞菌 同源重组 插入突变 蔗糖筛选
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会飞的鱼622

新虫 (初入文坛)

[求助] 假单胞菌 同源重组 插入突变 蔗糖筛选 已有2人参与

各位大侠请求帮助
我做的是假单胞菌羧卞抗性的基因敲除试验，选用的自杀质粒是PJQ200sk  gent抗性，将基因的ATG上下游500-600bp片段扩增出来，在ATG下游20bp左右插入卡那霉素抗性基因，然后连入PJQ200sk   
1.进行三亲杂交，在卡那霉素和羧卞的平板上长斑，pcr验证能够检测到突变后基因大小的片段，但是扩增不出来假单胞菌其他的基因，蔗糖筛选后也一样
2.进行电转，在卡那霉素和羧卞的平板上长斑，菌液pcr目的基因和其他基因都扩增不到，能再蔗糖板上张，也能在gent抗性的培养基中张
各位大侠帮帮忙

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1楼 2016-02-15 00:05:00
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岳大白

新虫 (初入文坛)
我和你做的差不多，目前是单交换进行的不顺利，也不知道什么原因

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2楼2016-02-23 15:55:32
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岳大白

新虫 (初入文坛)
你的三亲杂交是怎么做的，用没用到辅助质粒，能和我说说吗？

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3楼2016-02-23 15:56:24
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quiller2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2016-02-23 22:22:54
是杂菌吗？

1 是否有gen的抗性？
2 用单抗平板测试你的供体菌，受体菌和辅助菌确实能够用来筛选，而没有其它交叉的抗性
3 关于sacB的问题，在假单胞菌中本来就用的不大好，反正我们的是这样
4 三亲本后，挑取的单菌落多划线几次，然后用蔗糖筛选也是多划线几次--- ---别染杂菌了
5 主要看pcr的结果吧  sacB不是太好用，或者你的基因是条件致死了，长出来的都是突变了的，那就搞不定了
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会飞的鱼622
致良知
4楼2016-02-23 19:00:41
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会飞的鱼622

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by quiller2000 at 2016-02-23 19:00:41
是杂菌吗？

1 是否有gen的抗性？
2 用单抗平板测试你的供体菌，受体菌和辅助菌确实能够用来筛选，而没有其它交叉的抗性
3 关于sacB的问题，在假单胞菌中本来就用的不大好，反正我们的是这样
4 三亲本后，挑取 ...

是说我的双抗筛选后获得的单克隆是否有gent抗性是吗？
我的电转化后得到的转化子是有gent抗性的，三亲结合没试过是否有gent抗性
我做的基因不是致死基因
抗生素交叉抗性的问题，我试过辅助菌和供体菌两种菌不抗羧卞，受体菌不抗kana
麻烦帮我在分析一下可能还是哪些方面的问题

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5楼2016-02-26 19:06:24
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会飞的鱼622

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 岳大白 at 2016-02-23 15:56:24
你的三亲杂交是怎么做的，用没用到辅助质粒，能和我说说吗？

用辅助菌helper菌株

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6楼2016-02-26 19:07:05
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su2008su11

木虫 (正式写手)
想咨询一下，您将构建的片段，连接进自杀质粒的时候，用的是哪家公司的T4连接酶？是宝生物（TAKARA）吗？
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一命二运三风水四积阴德五读书
7楼2016-12-07 01:11:58
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远丽123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你好 我的问题和你的一模一样，我也是假单胞菌，我用的自杀质粒是pEX18GM,辅助菌是pRK600,我也是三亲后涂平板验证是对的（用敲出基因的1和4引物以及其他基因的引物都是有的，说明是单交换成功的菌），但是我再次挑目的菌在LB平板上划线时，就一点也长不出来了，偶尔会有一点点的菌长出来，但是用假单胞菌的其他基因来扩就扩不出，而且蔗糖后用敲除的1和4 引物验证还是对的，但是假单胞菌的其他基因还是没有，我就把蔗糖后的菌拿去测序，发现是大肠杆菌。我的猜测是单交换的假单胞菌死掉了（不明白为什么死掉，抗生素的选择是合适的），在LB上长出来的一点点的菌就是供体菌。但是为什么会这样我就不明白了，这一步也是卡了很久了，请问你后来问题解决了吗？？能否告知如何解决的，万分感谢！！
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8楼2017-12-28 15:59:21
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