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假单胞菌 同源重组 插入突变 蔗糖筛选 已有2人参与
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各位大侠请求帮助 我做的是假单胞菌羧卞抗性的基因敲除试验，选用的自杀质粒是PJQ200sk gent抗性，将基因的ATG上下游500-600bp片段扩增出来，在ATG下游20bp左右插入卡那霉素抗性基因，然后连入PJQ200sk 1.进行三亲杂交，在卡那霉素和羧卞的平板上长斑，pcr验证能够检测到突变后基因大小的片段，但是扩增不出来假单胞菌其他的基因，蔗糖筛选后也一样 2.进行电转，在卡那霉素和羧卞的平板上长斑，菌液pcr目的基因和其他基因都扩增不到，能再蔗糖板上张，也能在gent抗性的培养基中张 各位大侠帮帮忙 发自小木虫Android客户端 |
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2楼2016-02-23 15:55:32
3楼2016-02-23 15:56:24
quiller2000
木虫 (著名写手)
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4楼2016-02-23 19:00:41
送红花一朵 |
是说我的双抗筛选后获得的单克隆是否有gent抗性是吗？ 我的电转化后得到的转化子是有gent抗性的，三亲结合没试过是否有gent抗性 我做的基因不是致死基因 抗生素交叉抗性的问题，我试过辅助菌和供体菌两种菌不抗羧卞，受体菌不抗kana 麻烦帮我在分析一下可能还是哪些方面的问题 发自小木虫Android客户端 |
5楼2016-02-26 19:06:24
6楼2016-02-26 19:07:05
su2008su11
木虫 (正式写手)
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7楼2016-12-07 01:11:58
【答案】应助回帖
| 你好 我的问题和你的一模一样，我也是假单胞菌，我用的自杀质粒是pEX18GM,辅助菌是pRK600,我也是三亲后涂平板验证是对的（用敲出基因的1和4引物以及其他基因的引物都是有的，说明是单交换成功的菌），但是我再次挑目的菌在LB平板上划线时，就一点也长不出来了，偶尔会有一点点的菌长出来，但是用假单胞菌的其他基因来扩就扩不出，而且蔗糖后用敲除的1和4 引物验证还是对的，但是假单胞菌的其他基因还是没有，我就把蔗糖后的菌拿去测序，发现是大肠杆菌。我的猜测是单交换的假单胞菌死掉了（不明白为什么死掉，抗生素的选择是合适的），在LB上长出来的一点点的菌就是供体菌。但是为什么会这样我就不明白了，这一步也是卡了很久了，请问你后来问题解决了吗？？能否告知如何解决的，万分感谢！！ |
8楼2017-12-28 15:59:21