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王继楼马

新虫 (小有名气)

[求助] 连接转化问题,求教。已有2人参与

我这两天在做连接转化,有两个对照组,一个是只加质粒,一个是只加目的基因。连接反应是平末端连接。

结果发现,只加质粒的对照组菌落只有两三个,但是只加目的基因的对照组菌落却有十几二十个,实验组有50-60个。

为什么只加目的基因的对照组长得这么多,不科学啊!我板子是Amp,按只加质粒对照组来看,amp是没有失效的。个人认为目的基因也没有污染,因为是从其他质粒上酶切胶回收来的,跑胶看过很单一。

这是怎么回事?!有大神知道吗?
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lifechuteng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
楼主您的目的基因怎么获得的?PCR的话,模板是啥?
2楼2016-02-02 08:56:19
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yzc937168

金虫 (小有名气)

感觉酶切胶回收会带有一些完整质粒的污染,直接PCR目的基因试试。

发自小木虫Android客户端
吼吼吼~
3楼2016-02-02 09:56:09
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sloop112

禁虫 (小有名气)

感谢参与,应助指数 +1
本帖内容被屏蔽

4楼2016-02-03 09:16:05
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王继楼马

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-02-02 08:56:19
楼主您的目的基因怎么获得的?PCR的话,模板是啥?

从其他质粒上切下来的
5楼2016-02-04 21:03:59
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王继楼马

新虫 (小有名气)

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2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-02-02 08:56:19
楼主您的目的基因怎么获得的?PCR的话,模板是啥?

从其他质粒上切下来的
6楼2016-02-04 21:04:15
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王继楼马

新虫 (小有名气)

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3楼: Originally posted by yzc937168 at 2016-02-02 09:56:09
感觉酶切胶回收会带有一些完整质粒的污染,直接PCR目的基因试试。

有可能,我咨询了一下Technician。她也是这么说的。
7楼2016-02-04 21:04:56
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王继楼马

新虫 (小有名气)

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4楼: Originally posted by sloop112 at 2016-02-03 09:16:05
LZ,首先,问题很值得深思,但感觉实验设计以及实验描述不是很严谨。(1)“质粒组,长了,amp没有失效”,逻辑有问题,应当设置空白对照来证明amp的是否有效?LZ质粒组实验结果能看出此次转化效率不高,转化过程应 ...

1)我只是就我目前已有的几个分组进行的推测,我已经补了一个只有DH5α的转化板子,没有菌落,这说明AMP确实煤油失效。
2)我已经挑了24个克隆,进行了酶切鉴定,有四个是符合我片段预期的。我准备大提一下进行PCR检测。
3)连接比例是严格按照方程来的,由于需要上电泳图太麻烦,我就没提这一部分。

不过目前我有一个新问题,不知道仁兄可否解答一下,为什么我挑的24克隆在amp液体LB培养基中过夜培养,相同时间菌液密度不一致?
8楼2016-02-04 21:09:09
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王继楼马

新虫 (小有名气)

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3楼: Originally posted by yzc937168 at 2016-02-02 09:56:09
感觉酶切胶回收会带有一些完整质粒的污染,直接PCR目的基因试试。

不过目前我有一个新问题,不知道仁兄可否解答一下,为什么我挑的24克隆在amp液体LB培养基中过夜培养,相同时间菌液密度不一致?
9楼2016-02-04 21:09:23
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王继楼马

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-02-02 08:56:19
楼主您的目的基因怎么获得的?PCR的话,模板是啥?

不过目前我有一个新问题,不知道仁兄可否解答一下,为什么我挑的24克隆在amp液体LB培养基中过夜培养,相同时间菌液密度不一致?
10楼2016-02-04 21:09:34
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