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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接转化问题，求教。
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王继楼马

新虫 (小有名气)

[求助] 连接转化问题，求教。 已有2人参与

我这两天在做连接转化，有两个对照组，一个是只加质粒，一个是只加目的基因。连接反应是平末端连接。

结果发现，只加质粒的对照组菌落只有两三个，但是只加目的基因的对照组菌落却有十几二十个，实验组有50-60个。

为什么只加目的基因的对照组长得这么多，不科学啊！我板子是Amp，按只加质粒对照组来看，amp是没有失效的。个人认为目的基因也没有污染，因为是从其他质粒上酶切胶回收来的，跑胶看过很单一。

这是怎么回事？！有大神知道吗？
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1楼 2016-02-01 23:16:24
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lifechuteng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主您的目的基因怎么获得的？PCR的话，模板是啥？
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2楼2016-02-02 08:56:19
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yzc937168

金虫 (小有名气)
感觉酶切胶回收会带有一些完整质粒的污染，直接PCR目的基因试试。

发自小木虫Android客户端
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吼吼吼～
3楼2016-02-02 09:56:09
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sloop112

禁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
4楼2016-02-03 09:16:05
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王继楼马

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-02-02 08:56:19
楼主您的目的基因怎么获得的？PCR的话，模板是啥？

从其他质粒上切下来的
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5楼2016-02-04 21:03:59
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王继楼马

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-02-02 08:56:19
楼主您的目的基因怎么获得的？PCR的话，模板是啥？

从其他质粒上切下来的
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6楼2016-02-04 21:04:15
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王继楼马

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yzc937168 at 2016-02-02 09:56:09
感觉酶切胶回收会带有一些完整质粒的污染，直接PCR目的基因试试。

有可能，我咨询了一下Technician。她也是这么说的。
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7楼2016-02-04 21:04:56
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王继楼马

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sloop112 at 2016-02-03 09:16:05
LZ，首先，问题很值得深思，但感觉实验设计以及实验描述不是很严谨。（1）“质粒组，长了，amp没有失效”，逻辑有问题，应当设置空白对照来证明amp的是否有效？LZ质粒组实验结果能看出此次转化效率不高，转化过程应 ...

1）我只是就我目前已有的几个分组进行的推测，我已经补了一个只有DH5α的转化板子，没有菌落，这说明AMP确实煤油失效。
2）我已经挑了24个克隆，进行了酶切鉴定，有四个是符合我片段预期的。我准备大提一下进行PCR检测。
3）连接比例是严格按照方程来的，由于需要上电泳图太麻烦，我就没提这一部分。

不过目前我有一个新问题，不知道仁兄可否解答一下，为什么我挑的24克隆在amp液体LB培养基中过夜培养，相同时间菌液密度不一致？
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8楼2016-02-04 21:09:09
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王继楼马

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yzc937168 at 2016-02-02 09:56:09
感觉酶切胶回收会带有一些完整质粒的污染，直接PCR目的基因试试。

不过目前我有一个新问题，不知道仁兄可否解答一下，为什么我挑的24克隆在amp液体LB培养基中过夜培养，相同时间菌液密度不一致？
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9楼2016-02-04 21:09:23
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王继楼马

新虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-02-02 08:56:19
楼主您的目的基因怎么获得的？PCR的话，模板是啥？

不过目前我有一个新问题，不知道仁兄可否解答一下，为什么我挑的24克隆在amp液体LB培养基中过夜培养，相同时间菌液密度不一致？
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10楼2016-02-04 21:09:34
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