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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 有关无缝克隆的，求助！！！！
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那雨那女孩

新虫 (小有名气)

[求助] 有关无缝克隆的，求助！！！！ 已有2人参与

我最近要做无缝克隆，有以下问题，请各位大神帮忙，谢谢！！
1：获得线性载体的话，是用一种酶切，还是用两种酶切？ 酶切之后都要割胶回收吗？
2：无缝克隆的时候，需要考虑目的基因会不会移码这个问题吗？（这个是最重要的）
3：无缝克隆的时候，设计引物时，与线性载体重合的部分应该是是下图中 红色的一组 还是绿色的一组？
请各位指导，谢谢！！！！！

有关无缝克隆的，求助！！！！
问题3图.PNG
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辟邪
1楼 2016-01-19 14:25:00
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lifechuteng

新虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by 那雨那女孩 at 2016-01-19 19:04:41
可是，我的载体和目的基因都有ATG，是不是需要考虑会不会移码的问题？ 载体ATG和目的基因ATG之间的碱基数是3的倍数。...

这个就需要考虑的，一般载体上的ATG前面会有RBS区域，因此大多数都是从载体上的ATG开始翻译的，此时需要考虑移码问题，如果要调整移码，可以通过引物在基因的ATG前面增减碱基，不要引入终止密码子就好了~
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5楼2016-01-20 08:44:12
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江苏虞游

木虫 (正式写手)
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9楼: Originally posted by 那雨那女孩 at 2016-01-22 10:35:09
嗯嗯，谢谢！我想问一下，由于酶切有一个同源臂是少了几个碱基的，就是和目的基因之间有5,6个碱基的gap，pcr时有关系吗？
...

来晚了，不好意思哈，问题解决了吗？如果没有解决的话，同源臂一定要和载体上的一样，同源臂不会影响PCR扩增。
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10楼2016-02-29 16:30:13
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普通回帖

lifechuteng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
那雨那女孩: 金币+15, ★★★很有帮助, 谢谢！！第3个问题，我画了一下，发现太白痴了。谢谢！！！ 2016-01-19 16:04:56
1. 我推荐双酶切，因为双酶切可以最大程度避免载体自连，无缝克隆酶中有的会有连接酶存在。建议跑电泳，并做空白对照以确保切开。如果您的质粒不太大，我非常推荐使用反向PCR方式进行载体线性化，这样假阳性比较少。
2.一般基因都是自带ATG的吧，所以一般不需要考虑移码，如果是从质粒上的ATG开始翻译，那么需要考虑移码问题了。具体地方式跟传统的酶切连接是一样的。
3. 红色还是绿色我看不太懂，红色的应该跟质粒序列一样对吧，那就把红色的那段序列放到基因正向引物前面，后面红色那段方向互补之后，放到基因反向引物的前面就ok了
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2楼2016-01-19 15:22:40
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那雨那女孩

新虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-01-19 15:22:40
1. 我推荐双酶切，因为双酶切可以最大程度避免载体自连，无缝克隆酶中有的会有连接酶存在。建议跑电泳，并做空白对照以确保切开。如果您的质粒不太大，我非常推荐使用反向PCR方式进行载体线性化，这样假阳性比较少。 ...

可是，我的载体和目的基因都有ATG，是不是需要考虑会不会移码的问题？ 载体ATG和目的基因ATG之间的碱基数是3的倍数。
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辟邪
3楼2016-01-19 19:04:41
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那雨那女孩

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-01-19 15:22:40
1. 我推荐双酶切，因为双酶切可以最大程度避免载体自连，无缝克隆酶中有的会有连接酶存在。建议跑电泳，并做空白对照以确保切开。如果您的质粒不太大，我非常推荐使用反向PCR方式进行载体线性化，这样假阳性比较少。 ...

载体不止一个ATG，是不是从载体promoter区的第一个ATG开始数到目的基因ATG之间的碱基数是3的倍数？？
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辟邪
4楼2016-01-19 19:07:00
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lifechuteng

新虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by 那雨那女孩 at 2016-01-19 19:07:00
载体不止一个ATG，是不是从载体promoter区的第一个ATG开始数到目的基因ATG之间的碱基数是3的倍数？？...

一般载体promoter后面会标注出RBS位点和后面的ATG，这样的话，跟后面基因的ATG必须为3的倍数。
方便的话，可以上传一下您的质粒图谱~
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6楼2016-01-20 08:45:51
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那雨那女孩

新虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-01-20 08:45:51
一般载体promoter后面会标注出RBS位点和后面的ATG，这样的话，跟后面基因的ATG必须为3的倍数。
方便的话，可以上传一下您的质粒图谱~...

恩恩，谢谢！！！！
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辟邪
7楼2016-01-20 09:52:27
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江苏虞游

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
那雨那女孩: 金币+15, ★★★很有帮助, 谢谢！！！ 2016-01-23 13:54:41
最近刚做完Seamless，酶切位点的选择是双酶切；其次最为关键的就是同源臂的设计，在此基础上加上你的目的基因引物，高保真PCR扩增后回收片段，当然在此之间要考虑移码的问题，目的基因3端根据需要考虑是否加终止密码子；最后红绿代表的意思没看太明白，简单地说，同源臂有两个，其实就可以把它们看成一对引物，这样就简单多了。祝好
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8楼2016-01-21 01:04:30
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那雨那女孩

新虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by 江苏虞游 at 2016-01-21 01:04:30
最近刚做完Seamless，酶切位点的选择是双酶切；其次最为关键的就是同源臂的设计，在此基础上加上你的目的基因引物，高保真PCR扩增后回收片段，当然在此之间要考虑移码的问题，目的基因3端根据需要考虑是否加终止密码 ...

嗯嗯，谢谢！我想问一下，由于酶切有一个同源臂是少了几个碱基的，就是和目的基因之间有5,6个碱基的gap，pcr时有关系吗？

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辟邪
9楼2016-01-22 10:35:09
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