应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 有关无缝克隆的，求助！！！！
51/1返回列表
查看: 7856  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

那雨那女孩

新虫 (小有名气)

[求助] 有关无缝克隆的，求助！！！！ 已有2人参与

我最近要做无缝克隆，有以下问题，请各位大神帮忙，谢谢！！
1：获得线性载体的话，是用一种酶切，还是用两种酶切？ 酶切之后都要割胶回收吗？
2：无缝克隆的时候，需要考虑目的基因会不会移码这个问题吗？（这个是最重要的）
3：无缝克隆的时候，设计引物时，与线性载体重合的部分应该是是下图中 红色的一组 还是绿色的一组？
请各位指导，谢谢！！！！！

有关无缝克隆的，求助！！！！
问题3图.PNG
回复此楼

» 猜你喜欢
辟邪
1楼 2016-01-19 14:25:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

那雨那女孩

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-01-20 08:45:51
一般载体promoter后面会标注出RBS位点和后面的ATG，这样的话，跟后面基因的ATG必须为3的倍数。
方便的话，可以上传一下您的质粒图谱~...

恩恩，谢谢！！！！
回复此楼
辟邪
7楼2016-01-20 09:52:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答

lifechuteng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
那雨那女孩: 金币+15, ★★★很有帮助, 谢谢！！第3个问题，我画了一下，发现太白痴了。谢谢！！！ 2016-01-19 16:04:56
1. 我推荐双酶切，因为双酶切可以最大程度避免载体自连，无缝克隆酶中有的会有连接酶存在。建议跑电泳，并做空白对照以确保切开。如果您的质粒不太大，我非常推荐使用反向PCR方式进行载体线性化，这样假阳性比较少。
2.一般基因都是自带ATG的吧，所以一般不需要考虑移码，如果是从质粒上的ATG开始翻译，那么需要考虑移码问题了。具体地方式跟传统的酶切连接是一样的。
3. 红色还是绿色我看不太懂，红色的应该跟质粒序列一样对吧，那就把红色的那段序列放到基因正向引物前面，后面红色那段方向互补之后，放到基因反向引物的前面就ok了
赞一下 回复此楼
2楼2016-01-19 15:22:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

那雨那女孩

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-01-19 15:22:40
1. 我推荐双酶切，因为双酶切可以最大程度避免载体自连，无缝克隆酶中有的会有连接酶存在。建议跑电泳，并做空白对照以确保切开。如果您的质粒不太大，我非常推荐使用反向PCR方式进行载体线性化，这样假阳性比较少。 ...

可是，我的载体和目的基因都有ATG，是不是需要考虑会不会移码的问题？ 载体ATG和目的基因ATG之间的碱基数是3的倍数。
赞一下 回复此楼
辟邪
3楼2016-01-19 19:04:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

那雨那女孩

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-01-19 15:22:40
1. 我推荐双酶切，因为双酶切可以最大程度避免载体自连，无缝克隆酶中有的会有连接酶存在。建议跑电泳，并做空白对照以确保切开。如果您的质粒不太大，我非常推荐使用反向PCR方式进行载体线性化，这样假阳性比较少。 ...

载体不止一个ATG，是不是从载体promoter区的第一个ATG开始数到目的基因ATG之间的碱基数是3的倍数？？
赞一下 回复此楼
辟邪
4楼2016-01-19 19:07:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 请教下大家 2026年国家基金申请是双盲审吗？ +3 lishucheng1 2026-03-22 4/200 2026-03-23 20:48 by god_tian
[考研] 335求调剂 +3 yuyu宇 2026-03-23 4/200 2026-03-23 19:03 by macy2011
[考研] 上海电力大学材料防护与新材料重点实验室招收调剂研究生（材料、化学、电化学，环境） +3 我爱学电池 2026-03-23 3/150 2026-03-23 17:16 by AZMK
[考研] 298求调剂 +8 上岸6666@ 2026-03-20 8/400 2026-03-23 11:02 by laoshidan
[考研] 323求调剂 +6 洼小桶 2026-03-18 6/300 2026-03-23 00:29 by king123！
[考研] 0854电子信息求调剂 +3 α____ 2026-03-22 3/150 2026-03-22 21:28 by zhq0425
[考研] 289求调剂 +7 怀瑾握瑜l 2026-03-20 7/350 2026-03-22 15:57 by ColorlessPI
[考研] 求调剂院校信息 +6 CX 330 2026-03-21 6/300 2026-03-22 15:25 by 无懈可击111
[考博] 招收博士1-2人 +3 QGZDSYS 2026-03-18 4/200 2026-03-22 10:25 by QGZDSYS
[考研] 278求调剂 +9 烟火先于春 2026-03-17 9/450 2026-03-21 17:47 by 学员8dgXkO
[考研] 266求调剂 +3 哇呼哼呼哼 2026-03-20 3/150 2026-03-21 16:46 by barlinike
[基金申请] 学校已经提交到NSFC，还能修改吗？ 40+4 babangida 2026-03-19 9/450 2026-03-21 16:12 by babangida
[考研] 085601调剂 358分 +3 zzzzggh 2026-03-20 4/200 2026-03-21 10:21 by luoyongfeng
[考研] 346求调剂[0856] +4 WayneLim327 2026-03-16 7/350 2026-03-21 04:02 by JourneyLucky
[考研] 303求调剂 +5 睿08 2026-03-17 7/350 2026-03-21 03:11 by JourneyLucky
[考研] 一志愿南昌大学，327分，材料与化工085600 +9 Ncdx123456 2026-03-19 9/450 2026-03-20 23:41 by lovewei0727
[考研] 329求调剂 +9 想上学吖吖 2026-03-19 9/450 2026-03-20 22:01 by luoyongfeng
[考研] 295复试调剂 +8 简木ChuFront 2026-03-19 8/400 2026-03-20 20:44 by zhukairuo
[考研] 招收调剂硕士 +4 lidianxing 2026-03-19 12/600 2026-03-20 12:25 by lidianxing
[考研] 288求调剂，一志愿华南理工大学071005 +5 ioodiiij 2026-03-17 5/250 2026-03-19 18:22 by zcl123
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭