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有关无缝克隆的，求助！！！！已有2人参与
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我最近要做无缝克隆，有以下问题，请各位大神帮忙，谢谢！！ 1：获得线性载体的话，是用一种酶切，还是用两种酶切？ 酶切之后都要割胶回收吗？ 2：无缝克隆的时候，需要考虑目的基因会不会移码这个问题吗？（这个是最重要的） 3：无缝克隆的时候，设计引物时，与线性载体重合的部分应该是是下图中 红色的一组 还是绿色的一组？ 请各位指导，谢谢！！！！！  问题3图.PNG |
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3楼2016-01-19 19:04:41
lifechuteng
新虫 (小有名气)
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
那雨那女孩: 金币+15, ★★★很有帮助, 谢谢！！第3个问题，我画了一下，发现太白痴了。谢谢！！！ 2016-01-19 16:04:56
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1. 我推荐双酶切，因为双酶切可以最大程度避免载体自连，无缝克隆酶中有的会有连接酶存在。建议跑电泳，并做空白对照以确保切开。如果您的质粒不太大，我非常推荐使用反向PCR方式进行载体线性化，这样假阳性比较少。 2.一般基因都是自带ATG的吧，所以一般不需要考虑移码，如果是从质粒上的ATG开始翻译，那么需要考虑移码问题了。具体地方式跟传统的酶切连接是一样的。 3. 红色还是绿色我看不太懂，红色的应该跟质粒序列一样对吧，那就把红色的那段序列放到基因正向引物前面，后面红色那段方向互补之后，放到基因反向引物的前面就ok了 |
2楼2016-01-19 15:22:40
4楼2016-01-19 19:07:00
lifechuteng
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5楼2016-01-20 08:44:12