应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 有关无缝克隆的，求助！！！！
51/1返回列表
查看: 7842  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

那雨那女孩

新虫 (小有名气)

[求助] 有关无缝克隆的，求助！！！！ 已有2人参与

我最近要做无缝克隆，有以下问题，请各位大神帮忙，谢谢！！
1：获得线性载体的话，是用一种酶切，还是用两种酶切？ 酶切之后都要割胶回收吗？
2：无缝克隆的时候，需要考虑目的基因会不会移码这个问题吗？（这个是最重要的）
3：无缝克隆的时候，设计引物时，与线性载体重合的部分应该是是下图中 红色的一组 还是绿色的一组？
请各位指导，谢谢！！！！！

有关无缝克隆的，求助！！！！
问题3图.PNG
回复此楼

» 猜你喜欢
辟邪
1楼 2016-01-19 14:25:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

那雨那女孩

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-01-19 15:22:40
1. 我推荐双酶切，因为双酶切可以最大程度避免载体自连，无缝克隆酶中有的会有连接酶存在。建议跑电泳，并做空白对照以确保切开。如果您的质粒不太大，我非常推荐使用反向PCR方式进行载体线性化，这样假阳性比较少。 ...

可是，我的载体和目的基因都有ATG，是不是需要考虑会不会移码的问题？ 载体ATG和目的基因ATG之间的碱基数是3的倍数。
赞一下 回复此楼
辟邪
3楼2016-01-19 19:04:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答

lifechuteng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
那雨那女孩: 金币+15, ★★★很有帮助, 谢谢！！第3个问题，我画了一下，发现太白痴了。谢谢！！！ 2016-01-19 16:04:56
1. 我推荐双酶切，因为双酶切可以最大程度避免载体自连，无缝克隆酶中有的会有连接酶存在。建议跑电泳，并做空白对照以确保切开。如果您的质粒不太大，我非常推荐使用反向PCR方式进行载体线性化，这样假阳性比较少。
2.一般基因都是自带ATG的吧，所以一般不需要考虑移码，如果是从质粒上的ATG开始翻译，那么需要考虑移码问题了。具体地方式跟传统的酶切连接是一样的。
3. 红色还是绿色我看不太懂，红色的应该跟质粒序列一样对吧，那就把红色的那段序列放到基因正向引物前面，后面红色那段方向互补之后，放到基因反向引物的前面就ok了
赞一下 回复此楼
2楼2016-01-19 15:22:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

那雨那女孩

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-01-19 15:22:40
1. 我推荐双酶切，因为双酶切可以最大程度避免载体自连，无缝克隆酶中有的会有连接酶存在。建议跑电泳，并做空白对照以确保切开。如果您的质粒不太大，我非常推荐使用反向PCR方式进行载体线性化，这样假阳性比较少。 ...

载体不止一个ATG，是不是从载体promoter区的第一个ATG开始数到目的基因ATG之间的碱基数是3的倍数？？
赞一下 回复此楼
辟邪
4楼2016-01-19 19:07:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifechuteng

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 那雨那女孩 at 2016-01-19 19:04:41
可是，我的载体和目的基因都有ATG，是不是需要考虑会不会移码的问题？ 载体ATG和目的基因ATG之间的碱基数是3的倍数。...

这个就需要考虑的，一般载体上的ATG前面会有RBS区域，因此大多数都是从载体上的ATG开始翻译的，此时需要考虑移码问题，如果要调整移码，可以通过引物在基因的ATG前面增减碱基，不要引入终止密码子就好了~
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2016-01-20 08:44:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿上海交大生物与医药专硕324分，求调剂 +4 jiajunX 2026-03-22 4/200 2026-03-23 14:21 by xiaotangjing
[考研] 276求调剂。有半年电池和半年高分子实习经历 +8 材料学257求调剂 2026-03-23 9/450 2026-03-23 13:01 by ztnimte
[考研] 求调剂院校信息 +6 CX 330 2026-03-21 6/300 2026-03-22 15:25 by 无懈可击111
[考研] 260求调剂 +3 朱芷琳 2026-03-20 4/200 2026-03-22 15:12 by 朱芷琳
[考研] 考研调剂 +3 呼呼？~+123456 2026-03-21 3/150 2026-03-21 20:04 by 无际的草原
[考研] 求调剂 +3 13341 2026-03-20 3/150 2026-03-21 18:28 by 学员8dgXkO
[考研] 【考研调剂】化学专业 281分，一志愿四川大学，诚心求调剂 +11 吃吃吃才有意义 2026-03-19 11/550 2026-03-21 18:23 by 学员8dgXkO
[考研] 299求调剂 +4 某某某某位 2026-03-21 4/200 2026-03-21 16:30 by barlinike
[考研] 0805材料320求调剂 +3 深海物语 2026-03-20 3/150 2026-03-21 15:46 by 无际的草原
[考研] 332求调剂 +3 凤凰院丁真 2026-03-20 3/150 2026-03-21 10:27 by luoyongfeng
[考研] 南昌大学材料专硕311分求调剂 +6 77chaselx 2026-03-20 6/300 2026-03-21 07:24 by JourneyLucky
[考研] 一志愿华中科技大学，080502，354分求调剂 +5 守候夕阳CF 2026-03-18 5/250 2026-03-21 01:06 by JourneyLucky
[考研] 296求调剂 +6 www_q 2026-03-18 10/500 2026-03-20 23:56 by JourneyLucky
[考研] 274求调剂 +10 S.H1 2026-03-18 10/500 2026-03-20 23:51 by JourneyLucky
[考研] 304求调剂 +7 司空. 2026-03-18 7/350 2026-03-20 23:08 by JourneyLucky
[考研] 一志愿南理工085701环境302求调剂院校 +3 葵梓卫队 2026-03-20 3/150 2026-03-20 19:28 by zhukairuo
[考研] 085410人工智能专硕317求调剂（0854都可以） +4 xbxudjdn 2026-03-18 4/200 2026-03-20 09:07 by 不168
[考研] 一志愿中国海洋大学，生物学，301分，求调剂 +5 1孙悟空 2026-03-17 6/300 2026-03-19 23:46 by zcl123
[考研] 0703化学调剂 +3 妮妮ninicgb 2026-03-17 3/150 2026-03-18 10:29 by macy2011
[论文投稿] 有没有大佬发小论文能带我个二作 +3 增锐漏人 2026-03-17 4/200 2026-03-17 09:26 by xs74101122
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭