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那雨那女孩

新虫 (小有名气)

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10楼: Originally posted by 江苏虞游 at 2016-02-29 16:30:13
来晚了,不好意思哈,问题解决了吗?如果没有解决的话,同源臂一定要和载体上的一样,同源臂不会影响PCR扩增。...

好的,谢谢!!!
辟邪
11楼2016-03-01 16:04:29
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光明大道

新虫 (初入文坛)

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8楼: Originally posted by 江苏虞游 at 2016-01-21 01:04:30
最近刚做完Seamless,酶切位点的选择是双酶切;其次最为关键的就是同源臂的设计,在此基础上加上你的目的基因引物,高保真PCR扩增后回收片段,当然在此之间要考虑移码的问题,目的基因3端根据需要考虑是否加终止密码 ...

你好,你是用试剂盒做的吗?可以求一份详细步骤吗?

发自小木虫Android客户端
12楼2017-11-01 09:09:09
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梦与命

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-01-19 15:22:40
1. 我推荐双酶切,因为双酶切可以最大程度避免载体自连,无缝克隆酶中有的会有连接酶存在。建议跑电泳,并做空白对照以确保切开。如果您的质粒不太大,我非常推荐使用反向PCR方式进行载体线性化,这样假阳性比较少。 ...

您好 我载体单酶切后无缝克隆连我的基因  结果菌液PCR验证了30-40个都是没连上啊    是不是载体自连了啊   这个怎么解决?
13楼2020-08-16 11:00:23
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梦与命

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-01-19 15:22:40
1. 我推荐双酶切,因为双酶切可以最大程度避免载体自连,无缝克隆酶中有的会有连接酶存在。建议跑电泳,并做空白对照以确保切开。如果您的质粒不太大,我非常推荐使用反向PCR方式进行载体线性化,这样假阳性比较少。 ...

您好 我载体单酶切后无缝克隆连我的基因  结果菌液PCR验证了30-40个都是没连上啊    是不是载体自连了啊   这个怎么解决?
14楼2020-08-16 11:00:25
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梦与命

新虫 (小有名气)

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2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-01-19 15:22:40
1. 我推荐双酶切,因为双酶切可以最大程度避免载体自连,无缝克隆酶中有的会有连接酶存在。建议跑电泳,并做空白对照以确保切开。如果您的质粒不太大,我非常推荐使用反向PCR方式进行载体线性化,这样假阳性比较少。 ...

您好 我载体单酶切后无缝克隆连我的基因  结果菌液PCR验证了30-40个都是没连上啊    是不是载体自连了啊   这个怎么解决?
15楼2020-08-16 11:00:25
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