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[交流]
板子上长出菌落，但是菌落PCR没有得到目的片段 已有5人参与
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我要在PCS2+上连接nrf2a和gfp目的基因，其中nrf2a已经连接上，现在要连接gfp，设计了两个酶切位点，not1和sac2，可是这两个酶切位点很相近。 现在nrf2a连接上了，要连接gfp了，用takara的T4连接酶22度连接了2小时，涂氨苄板子，放于37度培养了14h左右，长出了菌落，但是菌落都是呈现那种半透明的样子。用引物PCS2+-F和M13-R扩增，只有1761左右的nrf2a大小，gfp并没有连接上。到底什么原因？求助连接体系怎么确定啊？  浓度.jpg  链接公式.jpg  链接体系.jpg  板子.jpg  PCR程序.jpg  nrf2a-gfp-pcs2+ pcr.jpg |
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xiangyingliu
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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| The ligation system worked perfectly. The problem came from the double digestion reaction incompletely. Therefore, you could digest the backbone vector in two single digestion reaction step by step. Anyway, please set up the negative control just without insert DNA, which is used for the identification of digestion efficiency. |
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