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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求教求教:Taq酶作用？？？有没有人告诉我
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紫萸香慢001

新虫 (小有名气)
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9楼: Originally posted by xiaoweiwei121 at 2016-01-17 04:20:29
要去DNA，要用DNase I.
提RNA，有dna 污染是很普遍的
我用TRI reagent
如果放的样品很少，取上层很少的上清，还是可以避免dna污染...

主要是我用的方案，在第一步就把ep管里的菌液给离心取沉淀了，没有取上清的步骤，所以很想跟你交流一下

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11楼2016-01-17 08:24:51
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原来，是这样

金虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by 紫萸香慢001 at 2016-01-16 23:42:29
我就是用的提RNA的试剂盒，为验证没有DNA污染，我就拿提取的mRNA，用普通DNA的试剂盒扩增相应目的片段，结果还有阳性结果，这说明有DNA污染，但是我已经很注意了，不知道怎么去除DNA污染，然后我看有的文献说Taq酶 ...

提取RNA做不到百分百纯，绝对会混有DNA的，在进行反转录的时候必须用DNA酶消化，去除所有RNA，不知道你查的是什么文献，总之taq酶没有逆转录功能。有些反转录试剂盒里面有DNA消化酶，比如说我用的takara公司反转录试剂盒，你要是没有的话单独去买一个消化DNA的试剂盒吧。

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12楼2016-01-17 09:15:21
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bright8

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
当然不行了，那是反转酶才行啦！

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13楼2016-01-17 09:20:13
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紫萸香慢001

新虫 (小有名气)
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12楼: Originally posted by 原来，是这样 at 2016-01-17 09:15:21
提取RNA做不到百分百纯，绝对会混有DNA的，在进行反转录的时候必须用DNA酶消化，去除所有RNA，不知道你查的是什么文献，总之taq酶没有逆转录功能。有些反转录试剂盒里面有DNA消化酶，比如说我用的takara公司反转录 ...

嗯嗯，我也是买了专门的试剂盒，我之所以问Taq酶有没有逆转录酶作用原因是这样的，为验证无DNA污染，我将提好的mRNA用taq酶扩增相应目的片段，普通PCR跑胶结果是阳性的，每次都这样，我找不到原因，就猜想会不会taq酶也会对RNA起作用。另外，请问你做的是原核生物还是真核生物，提取的时候加了多少量，怎么验证没有DNA污染的。谢谢你啦

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14楼2016-01-17 10:27:34
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dadhz

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主，看完你的描述，我的结论是，有百分之九十九可能性，你的mRNA中有DNA污染。
买个好一点的DNase I, 加到mRNA中，按照说明书指导的条件，彻底消化掉DNA，之后再扩增看看，还有没有条带。

至于taq酶有没有反转录活性，你如果有兴趣的话，可以换个其他的pcr高保真酶，替代掉taq酶，看看是不是仍旧能p出东西，依旧能扩增出条带的话，那是不是更加证明了DNA的污染？

补一句，你说的文献报道的taq酶的反转录活性，是在什么样的条件下？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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15楼2016-01-17 18:46:33
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原来，是这样

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by 紫萸香慢001 at 2016-01-17 10:27:34
嗯嗯，我也是买了专门的试剂盒，我之所以问Taq酶有没有逆转录酶作用原因是这样的，为验证无DNA污染，我将提好的mRNA用taq酶扩增相应目的片段，普通PCR跑胶结果是阳性的，每次都这样，我找不到原因，就猜想会不会ta ...

我是做植物的，提取了RNA后直接取1ugRNA先用DNase消化5分钟然后做反转录，没有做PCR验证，因为只要做了DNA消化，百分百是可以除尽DNA的，如果你不放心，那就在消化之后再做一遍PCR验证就好了，记得PCR验证之前把消化体系加热灭除DNase活性，然后再取0.5ul去做模板，如果结果为阴性，结合你没做消化结果为阳性，那样就很好像别人说明你这个的的确确去除了DNA污染。住楼主实验顺利。

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16楼2016-01-17 23:36:20
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紫萸香慢001

新虫 (小有名气)
嗯嗯，谢谢你的热心解答，我看的文献只是提到Taq酶有反转录酶活性并未提及反应条件，请用你做的时候DNA酶是怎么使用的，我买了天根的和普洛麦格的试剂盒都不行啊

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17楼2016-01-18 00:06:26
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紫萸香慢001

新虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 原来，是这样 at 2016-01-17 23:36:20
我是做植物的，提取了RNA后直接取1ugRNA先用DNase消化5分钟然后做反转录，没有做PCR验证，因为只要做了DNA消化，百分百是可以除尽DNA的，如果你不放心，那就在消化之后再做一遍PCR验证就好了，记得PCR验证之前把消 ...

也就是说你是在提完RNA，最后再用的DNA酶对吗

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18楼2016-01-18 00:09:44
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原来，是这样

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
18楼: Originally posted by 紫萸香慢001 at 2016-01-18 00:09:44
也就是说你是在提完RNA，最后再用的DNA酶对吗
...

对，试剂盒说明书好好读读，没有问题的。

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19楼2016-01-18 11:09:16
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纳米之心

木虫 (文坛精英)
祝福楼主
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火星人要回火星了！！！
20楼2016-01-18 11:41:17
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