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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » His标签木聚糖酶不挂住
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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张小蛋

新虫 (小有名气)

[求助] His标签木聚糖酶不挂住 已有4人参与

已经做了好几次纯化了，均不挂住，在穿透液里就流出来了，洗脱液里只有一点点，我是通过测木聚糖酶活来看的，看颜色的深浅。
我测的是Xyn-II等电点是8.7
具体做法是，1．缓冲液准备
A液，1XTris-HCl缓冲液pH8.0，含有8~20mM咪唑
B液，1XTris-HCl缓冲液pH8.0，含有8~80mM咪唑
C液，1XTris-HCl缓冲液pH8.0，含有250mM咪唑
2．样品的准备
  收集细菌或者细胞，以适当体积的A液重悬，超声破碎，或采用其他酶解方法破碎细胞，高速离心除去细胞碎片，取上清备用
3.亲和层析柱的准备
50%的琼脂糖珠，颠倒重悬混匀，取1ml混悬液加入层析柱中，水分靠重力过滤除去，得到0.5ml柱床体积的琼脂糖珠。加入5倍柱床体积的A液（2.5ml）平衡琼脂糖珠。
4.上样
  上述步骤2得到的上清，分批加入层析柱，过滤流出的液体为穿透液
5.以10倍柱床体积的B液，洗涤琼脂糖珠，过滤流出的液体为洗涤液
6.以6倍柱床体积的C液，洗脱蛋白（洗脱的蛋白一般在第一体积和第二体积，第三积仅有很少量。一般第一体积杂蛋白较多，第二体积蛋白较纯）过滤流出的液体为洗脱液
完全按照说明书来做的
后来导师说是不挂住，我就用了8M的尿素，直接加到上述2样品准备的粗酶液里孵育半小时，可是还是不挂住~我用的质粒时老板从外国要过来了，有原始论文，论文里用的是阳离子交换色谱法，导师让我 用NI-NTA亲和层析，研一刚接触试验，有好多不太明白的地方，希望大家授业解惑~~感激不尽~
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1楼 2016-01-16 16:16:57
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张小蛋

新虫 (小有名气)
为什么每次发帖大家都不理我~
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5楼2016-01-16 18:08:27
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普通回帖

张小蛋

新虫 (小有名气)
希望大家帮帮我吧~~理解一下我焦急的心情~~谢谢谢谢啦~~
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2楼2016-01-16 16:23:12
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
为什么不按文献发表的方法去做呢，这样发文章别人也不会挑刺啊
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行至水穷处，坐看云起时
3楼2016-01-16 17:16:28
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张小蛋

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by pennchem at 2016-01-16 17:16:28
为什么不按文献发表的方法去做呢，这样发文章别人也不会挑刺啊

呃~我们导师让我用这个~我也没办法~谢谢您的回答
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4楼2016-01-16 17:38:50
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)
重新构建载体，两端都加his

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6楼2016-01-16 19:05:39
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张小蛋

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by biosci at 2016-01-16 19:05:39
重新构建载体，两端都加his

谢谢~
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7楼2016-01-16 19:18:12
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bright8

铁杆木虫 (著名写手)
换载体吧！这个可能就是蛋白表达的时候,his_tag包裹再里面了，没有暴露在蛋白的外面了，导致不挂柱啦！建议换载体试一试或者按照别人文献的方法试一下。

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8楼2016-01-16 22:11:34
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张小蛋

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by bright8 at 2016-01-16 22:11:34
换载体吧！这个可能就是蛋白表达的时候,his_tag包裹再里面了，没有暴露在蛋白的外面了，导致不挂柱啦！建议换载体试一试或者按照别人文献的方法试一下。

或许可以用尿素让她它变性一下么呢~
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9楼2016-01-16 22:22:57
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qiidong

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
缓冲液里没有加高浓度nacl？需要加300或500mmol盐

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10楼2016-01-16 22:36:07
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