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His标签木聚糖酶不挂住 已有4人参与
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已经做了好几次纯化了，均不挂住，在穿透液里就流出来了，洗脱液里只有一点点，我是通过测木聚糖酶活来看的，看颜色的深浅。 我测的是Xyn-II等电点是8.7 具体做法是，1．缓冲液准备 A液，1XTris-HCl缓冲液pH8.0，含有8~20mM咪唑 B液，1XTris-HCl缓冲液pH8.0，含有8~80mM咪唑 C液，1XTris-HCl缓冲液pH8.0，含有250mM咪唑 2．样品的准备 收集细菌或者细胞，以适当体积的A液重悬，超声破碎，或采用其他酶解方法破碎细胞，高速离心除去细胞碎片，取上清备用 3.亲和层析柱的准备 50%的琼脂糖珠，颠倒重悬混匀，取1ml混悬液加入层析柱中，水分靠重力过滤除去，得到0.5ml柱床体积的琼脂糖珠。加入5倍柱床体积的A液（2.5ml）平衡琼脂糖珠。 4.上样 上述步骤2得到的上清，分批加入层析柱，过滤流出的液体为穿透液 5.以10倍柱床体积的B液，洗涤琼脂糖珠，过滤流出的液体为洗涤液 6.以6倍柱床体积的C液，洗脱蛋白（洗脱的蛋白一般在第一体积和第二体积，第三积仅有很少量。一般第一体积杂蛋白较多，第二体积蛋白较纯）过滤流出的液体为洗脱液 完全按照说明书来做的 后来导师说是不挂住，我就用了8M的尿素，直接加到上述2样品准备的粗酶液里孵育半小时，可是还是不挂住~我用的质粒时老板从外国要过来了，有原始论文，论文里用的是阳离子交换色谱法，导师让我 用NI-NTA亲和层析，研一刚接触试验，有好多不太明白的地方，希望大家授业解惑~~感激不尽~ |
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7楼2016-01-16 19:18:12
bright8
铁杆木虫 (著名写手)
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换载体吧！这个可能就是蛋白表达的时候,his_tag包裹再里面了，没有暴露在蛋白的外面了，导致不挂柱啦！建议换载体试一试或者按照别人文献的方法试一下。 发自小木虫Android客户端 |
8楼2016-01-16 22:11:34
9楼2016-01-16 22:22:57
10楼2016-01-16 22:36:07
