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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 请教一个酵母单杂交的问题
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1002432022

金虫 (小有名气)

[求助] 请教一个酵母单杂交的问题 已有2人参与

最近做单杂实验发现一个怪问题，我做点对点的。我把要验证的转录因子构建到pGADT7-rec2载体上，与pHis2的空载共同转化Y187，本来要拿这个做阴性对照的，可是在三缺板子上长得很欢乐呀，加了3AT，并且已经加的浓度很高了，还是生长！但是我的实验组，就是转录因子构建到pGADT7-rec2载体上，目标启动子构建到pHis2载体上共同转化Y187，在三缺板上长，加了3AT之后反倒不长了！有没有大神遇到过类似问题，或者帮忙解释一下？
还有一点，我看了pHIS2的序列，在HIS3前面，Pmin区域里也有我的转录因子结合位点，会不会是我的转录因子结合到那里去了？不知道有没有这个可能性啊？这个minimum promoter是不是只有GAL4AD才能结合呢？如果非要做，这段区域能不能改造呢？求指点啊~
还有，我也试过了pAbAi系统的，一样的问题，只转了空载pAbAi，然后再把我的转录因子构建在pGADT7上，转化，AbA已经加到3ug/ml了，还是生长！求指点这种激活空载的问题怎么解决啊~~~
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1楼 2015-12-21 12:15:16
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1002432022

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hmgder at 2016-03-03 20:06:26
刚刚开始准备做酵母杂交，有两个小问题想请教大家
1. 酵母转化过程中没有抗生素，全程要在无菌台操作吗？那水浴和离心过程怎么办呢
2. 不知道你们用电转化还是醋酸锂，化学转化30度水浴紧接着就是42度水浴，要准备 ...

酵母不用抗生素，所以操作要十分小心，因为很容易污染。离心只要盖好离心管盖子拿出来离心就好了，水浴一样的。

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6楼2016-03-03 23:54:37
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qingxiong

木虫 (正式写手)
我也遇到了跟你一样的问题，不知道楼主是否解决
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12楼2018-08-03 08:49:26
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piaoyidetian

新虫 (初入文坛)
我准备开始做酵母单杂交，但是启动子区域的选择想请教一下？是选取ATG上游2000的片段，然后整个连到pHIS2载体上吗？
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2楼2016-01-14 15:29:38
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1002432022

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by piaoyidetian at 2016-01-14 15:29:38
我准备开始做酵母单杂交，但是启动子区域的选择想请教一下？是选取ATG上游2000的片段，然后整个连到pHIS2载体上吗？

我之前做了直接取ATG上游1.5k构建到phis2上，感觉不合适。最好还是找到自己转录因子的结合motif然后取motif和其上下游几十bp的片段，然后串联3个片段构建载体比较合适。
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3楼2016-02-04 19:53:25
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张凡云

至尊木虫 (职业作家)
我们用的AH109菌株，载体是pBridge，所以木有遇到你说的这些问题

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4楼2016-02-05 08:42:12
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hmgder

新虫 (初入文坛)
刚刚开始准备做酵母杂交，有两个小问题想请教大家
1. 酵母转化过程中没有抗生素，全程要在无菌台操作吗？那水浴和离心过程怎么办呢
2. 不知道你们用电转化还是醋酸锂，化学转化30度水浴紧接着就是42度水浴，要准备两个水浴锅吗

问题很傻，谢谢你们的解答~
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5楼2016-03-03 20:06:26
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1002432022

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hmgder at 2016-03-03 20:06:26
刚刚开始准备做酵母杂交，有两个小问题想请教大家
1. 酵母转化过程中没有抗生素，全程要在无菌台操作吗？那水浴和离心过程怎么办呢
2. 不知道你们用电转化还是醋酸锂，化学转化30度水浴紧接着就是42度水浴，要准备 ...

我们用的醋酸锂，30度放在培养箱就好了，反正酵母要30度培养嘛！另外，我们实验室现在水浴的操作基本都改成恒温金属浴了，调节温度很快，就不需要搞两个水浴锅什么的了。

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7楼2016-03-03 23:59:09
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hmgder

新虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by 1002432022 at 2016-03-03 23:59:09
我们用的醋酸锂，30度放在培养箱就好了，反正酵母要30度培养嘛！另外，我们实验室现在水浴的操作基本都改成恒温金属浴了，调节温度很快，就不需要搞两个水浴锅什么的了。
...

太感谢你了~
总感觉恒温箱温度不太准呢。。
那从恒温箱到水浴锅这段距离要放在冰上吗，还是说没有那么严格，室温就好呢
还有想问，感受态细胞如果不转质粒，能像大肠杆菌一样直接复苏吗，具体怎么操作呢
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8楼2016-03-04 11:18:33
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1002432022

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by hmgder at 2016-03-04 11:18:33
太感谢你了~
总感觉恒温箱温度不太准呢。。
那从恒温箱到水浴锅这段距离要放在冰上吗，还是说没有那么严格，室温就好呢
还有想问，感受态细胞如果不转质粒，能像大肠杆菌一样直接复苏吗，具体怎么操作呢...

不用放冰上，酵母感受态现做现用，不保存的。

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9楼2016-03-05 12:12:12
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寒冰利剑

金虫 (小有名气)
你好，我最近也在做酵母单杂交，用的是y187，之前实验室可能把酵母菌污染了，之后划线，酵母菌落长得很快，菌落形态不太一样，因此，想问问酵母单杂可不可以用AH109，质粒用的是PGADT 7和phis 2载体。

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岂能尽如人意，但求无愧我心。
10楼2016-11-26 11:03:42
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