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南方科技大学公共卫生及应急管理学院2026级博士研究生招生报考通知(长期有效)
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哥哥呵呵笑

新虫 (初入文坛)

[求助] 启动子与ATG的问题已有4人参与

各位大神,我在做表达载体,因为一开始没经验,当初在设计引物的时候在5’和3’端都加上了保护碱基(貌似都只在5‘端加),
结果现在做出来的表达载体测序发现在目的基因前面多了2个碱基。
我的目的基因本身是ATG开始,TAA结尾的,现在相当于在ATG前面多了CG两个碱基。
我用的pET-28α(+),NheI、XhoI双酶切,看了下图谱,从T7启动子到目的基因之间载体本身还有2个ATG位点,我又好死不死的在
目的基因前面多加了个CG,现在搞得不是3的整数倍了……
想请教大家,启动子转录之后的翻译是怎样的?是从载体本身的第一个ATG开始,还是从每一个ATG都会各自翻译出一条蛋白
我现在希望它能从目的基因的开头那个ATG翻译出来一条,那前面那个CG是不是就不会引起后面的框移突变了?
谢谢各位了!!
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
哥哥呵呵笑: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 谢谢了,准备重新做 2015-12-18 10:08:17
是从(NCOI酶)启动子后面的第一个ATG开始往下延伸,后面的ATG只会翻译成蛋氨酸。你的蛋白移码了,重新连吧。
采菊东篱下,悠然见南山。
6楼2015-12-16 16:59:24
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科学小覃

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
从来没见过在引物3‘端加保护碱基的,你居然p出来了,我也是醉了
生物科学
13楼2015-12-17 19:17:55
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普通回帖

wujiangjack

银虫 (初入文坛)

这个载体上面带有His标签,看你选择了,前后都有
2楼2015-12-16 10:11:55
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哥哥呵呵笑

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wujiangjack at 2015-12-16 10:11:55
这个载体上面带有His标签,看你选择了,前后都有

你好,我想问的是蛋白翻译,跟his貌似没关系吧?
3楼2015-12-16 10:19:42
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ltf329395464

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
仔细看载体图谱。PET-28a如果要用Xho I做下游引物,一定要补齐你酶切时损失的那个碱基,不然就移码了。
ONLY I CAN !
4楼2015-12-16 14:41:12
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哥哥呵呵笑

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by ltf329395464 at 2015-12-16 14:41:12
仔细看载体图谱。PET-28a如果要用Xho I做下游引物,一定要补齐你酶切时损失的那个碱基,不然就移码了。

请问一下原核表达是从启动子后面的第一个ATG开始往下延伸还是说每一个ATG开始都会各自翻译?
5楼2015-12-16 15:31:51
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哥哥呵呵笑

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 781055707 at 2015-12-16 16:59:24
是从(NCOI酶)启动子后面的第一个ATG开始往下延伸,后面的ATG只会翻译成蛋氨酸。你的蛋白移码了,重新连吧。

感谢您的回答,再请问一下如果没有那2个碱基的话,翻译出的蛋白从NcoI到目的基因前面的这一段还需要我另外除掉吗?
7楼2015-12-16 19:25:20
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
重做吧,前面有标签,肯定会移码的。
8楼2015-12-17 08:33:05
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781055707

木虫 (著名写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 哥哥呵呵笑 at 2015-12-16 19:25:20
感谢您的回答,再请问一下如果没有那2个碱基的话,翻译出的蛋白从NcoI到目的基因前面的这一段还需要我另外除掉吗?...

从(NCOI酶)的ATG开始,只要3个3个就不会移码了,其他的不用考虑。
采菊东篱下,悠然见南山。
9楼2015-12-17 09:31:33
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yangtzelv

新虫 (小有名气)

移码了
重新做
10楼2015-12-17 17:01:42
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