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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 启动子与ATG的问题
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哥哥呵呵笑

新虫 (初入文坛)

[求助] 启动子与ATG的问题 已有4人参与

各位大神，我在做表达载体，因为一开始没经验，当初在设计引物的时候在5’和3’端都加上了保护碱基（貌似都只在5‘端加），
结果现在做出来的表达载体测序发现在目的基因前面多了2个碱基。
我的目的基因本身是ATG开始，TAA结尾的，现在相当于在ATG前面多了CG两个碱基。
我用的pET-28α（+），NheI、XhoI双酶切，看了下图谱，从T7启动子到目的基因之间载体本身还有2个ATG位点，我又好死不死的在
目的基因前面多加了个CG，现在搞得不是3的整数倍了……
想请教大家，启动子转录之后的翻译是怎样的？是从载体本身的第一个ATG开始，还是从每一个ATG都会各自翻译出一条蛋白
我现在希望它能从目的基因的开头那个ATG翻译出来一条，那前面那个CG是不是就不会引起后面的框移突变了？
谢谢各位了!!
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1楼 2015-12-16 09:55:24
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
哥哥呵呵笑: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 谢谢了，准备重新做 2015-12-18 10:08:17
是从（NCOI酶）启动子后面的第一个ATG开始往下延伸，后面的ATG只会翻译成蛋氨酸。你的蛋白移码了，重新连吧。
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采菊东篱下，悠然见南山。
6楼2015-12-16 16:59:24
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科学小覃

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
从来没见过在引物3‘端加保护碱基的，你居然p出来了，我也是醉了
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生物科学
13楼2015-12-17 19:17:55
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普通回帖

wujiangjack

银虫 (初入文坛)
这个载体上面带有His标签，看你选择了，前后都有
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2楼2015-12-16 10:11:55
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哥哥呵呵笑

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wujiangjack at 2015-12-16 10:11:55
这个载体上面带有His标签，看你选择了，前后都有

你好，我想问的是蛋白翻译，跟his貌似没关系吧？
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3楼2015-12-16 10:19:42
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ltf329395464

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
仔细看载体图谱。PET-28a如果要用Xho I做下游引物，一定要补齐你酶切时损失的那个碱基，不然就移码了。
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ONLY I CAN !
4楼2015-12-16 14:41:12
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哥哥呵呵笑

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ltf329395464 at 2015-12-16 14:41:12
仔细看载体图谱。PET-28a如果要用Xho I做下游引物，一定要补齐你酶切时损失的那个碱基，不然就移码了。

请问一下原核表达是从启动子后面的第一个ATG开始往下延伸还是说每一个ATG开始都会各自翻译？
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5楼2015-12-16 15:31:51
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哥哥呵呵笑

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 781055707 at 2015-12-16 16:59:24
是从（NCOI酶）启动子后面的第一个ATG开始往下延伸，后面的ATG只会翻译成蛋氨酸。你的蛋白移码了，重新连吧。

感谢您的回答，再请问一下如果没有那2个碱基的话，翻译出的蛋白从NcoI到目的基因前面的这一段还需要我另外除掉吗？
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7楼2015-12-16 19:25:20
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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
重做吧，前面有标签，肯定会移码的。
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8楼2015-12-17 08:33:05
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781055707

木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 哥哥呵呵笑 at 2015-12-16 19:25:20
感谢您的回答，再请问一下如果没有那2个碱基的话，翻译出的蛋白从NcoI到目的基因前面的这一段还需要我另外除掉吗？...

从（NCOI酶）的ATG开始，只要3个3个就不会移码了，其他的不用考虑。
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采菊东篱下，悠然见南山。
9楼2015-12-17 09:31:33
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yangtzelv

新虫 (小有名气)
移码了
重新做
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10楼2015-12-17 17:01:42
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