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crab1983

铜虫 (小有名气)

[求助] 已知一个基因通过转录组获得的cDNA序列，如何设计引物克隆这个基因 已有1人参与

我手里有想要克隆的基因的转录组获得的cDNA序列，但不知道如何设计引物。我看有的人用RACE的方法克隆全长，我不需要克隆全长。我原来以为，把拿到的转录组的这个cDNA序列直接设计引物就行，但是我看到很多文献，都是找出开放阅读框来设计引物的。所以现在不知道该怎么做了，太着急了。请给位大侠帮帮忙。
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1楼 2015-12-14 18:24:28
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

jianguochen

新虫 (小有名气)
主要还是看你扩增出来的序列用于做什么，表达的话可以分析下你的序列里共有多少个开放阅读框，哪个阅读框是你的序列。再根据ORF序列从起始密码子到终止密码子设计引物扩就是了。
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2楼2015-12-14 18:39:54
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
crab1983: 金币+3, ★★★很有帮助 2016-03-11 15:14:49
先用你的序列做blastx，看是否含有完整ORF，看编码区的具体位置，然后再根据你的需要设计引物，做定量的话，不需要有完整ORF，但是如果做表达研究功能，那需要有完整ORF，如没有，就做RACE扩全长。
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3楼2015-12-15 11:48:44
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yvonne9044

新虫 (正式写手)
有转录组就不用做race了吧？我就用转录组数据设计的引物

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8楼2015-12-15 22:31:12
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jianguochen

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by crab1983 at 2015-12-15 17:51:01
我就是要这个基因克隆出来，然后转到拟南芥里面，鉴定一下。该怎么做呀？
...

转到拟南芥里做表达的话，就扩增完整的ORF，需要的话，加上酶切位点用于后面的载体连接。转拟南芥的话你们实验室要是有这方面的经验就没什么难度，没有的话可以考虑送公司，很快的。还有就是你这个基因的功能是什么，转入后如何检测及预期结果。
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9楼2015-12-16 09:15:10
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by crab1983 at 2016-03-11 15:18:01
用blastx怎么能看出我的序列是不是完整的ORF呀。...

看你cDNA序列比对区域和匹配上的蛋白序列比对区域，举个例子，你的cDNA长度是1100bp，比对上的区域是100-1000bp，与数据库里某全长为300aa的蛋白的1-300匹配上了，那说明你的序列是包括完整的ORF。如果与数据库里某全长为400aa的蛋白的100-400aa匹配上了，那说明你的序列ORF缺少5'端。
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17楼2016-03-11 21:06:39
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普通回帖

crab1983

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jianguochen at 2015-12-14 18:39:54
主要还是看你扩增出来的序列用于做什么，表达的话可以分析下你的序列里共有多少个开放阅读框，哪个阅读框是你的序列。再根据ORF序列从起始密码子到终止密码子设计引物扩就是了。

我就是要这个基因克隆出来，然后转到拟南芥里面，鉴定一下。该怎么做呀？

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4楼2015-12-15 17:51:01
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crab1983

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by stone2239 at 2015-12-15 11:48:44
先用你的序列做blastx，看是否含有完整ORF，看编码区的具体位置，然后再根据你的需要设计引物，做定量的话，不需要有完整ORF，但是如果做表达研究功能，那需要有完整ORF，如没有，就做RACE扩全长。

我要转到拟南芥中，转到拟南芥里面主要鉴定一下这个基因。也就是得在拟南芥里表达

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5楼2015-12-15 17:52:44
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star013

新虫 (知名作家)
做race的，可以过的基因全长，无论是定量还是表达，都可以用了，我们可以做race

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6楼2015-12-15 19:20:42
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fakirheart

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by crab1983 at 2015-12-15 17:51:01
我就是要这个基因克隆出来，然后转到拟南芥里面，鉴定一下。该怎么做呀？
...

那你这个工作量大呀，还得连接表达载体

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我是读书人
7楼2015-12-15 21:25:12
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crab1983

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by jianguochen at 2015-12-16 09:15:10
转到拟南芥里做表达的话，就扩增完整的ORF，需要的话，加上酶切位点用于后面的载体连接。转拟南芥的话你们实验室要是有这方面的经验就没什么难度，没有的话可以考虑送公司，很快的。还有就是你这个基因的功能是什么 ...

我这个基因是植物光合作用过程中的酶，理论上转到拟南芥中应该能提高拟南芥的光合速率。
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10楼2016-02-23 10:25:15
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