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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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crab1983

主管区长

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[求助] 已知一个基因通过转录组获得的cDNA序列,如何设计引物克隆这个基因 已有1人参与

我手里有想要克隆的基因的转录组获得的cDNA序列,但不知道如何设计引物。我看有的人用RACE的方法克隆全长,我不需要克隆全长。我原来以为,把拿到的转录组的这个cDNA序列直接设计引物就行,但是我看到很多文献,都是找出开放阅读框来设计引物的。所以现在不知道该怎么做了,太着急了。请给位大侠帮帮忙。
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jianguochen

超级版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

主要还是看你扩增出来的序列用于做什么,表达的话可以分析下你的序列里共有多少个开放阅读框,哪个阅读框是你的序列。再根据ORF序列从起始密码子到终止密码子设计引物扩就是了。
2楼2015-12-14 18:39:54
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stone2239

兑换贵宾

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
crab1983: 金币+3, ★★★很有帮助 2016-03-11 15:14:49
先用你的序列做blastx,看是否含有完整ORF,看编码区的具体位置,然后再根据你的需要设计引物,做定量的话,不需要有完整ORF,但是如果做表达研究功能,那需要有完整ORF,如没有,就做RACE扩全长。
3楼2015-12-15 11:48:44
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yvonne9044

专家顾问

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

有转录组就不用做race了吧?我就用转录组数据设计的引物

发自小木虫Android客户端
8楼2015-12-15 22:31:12
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jianguochen

兑换贵宾

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引用回帖:
4楼: Originally posted by crab1983 at 2015-12-15 17:51:01
我就是要这个基因克隆出来,然后转到拟南芥里面,鉴定一下。该怎么做呀?
...

转到拟南芥里做表达的话,就扩增完整的ORF,需要的话,加上酶切位点用于后面的载体连接。转拟南芥的话你们实验室要是有这方面的经验就没什么难度,没有的话可以考虑送公司,很快的。还有就是你这个基因的功能是什么,转入后如何检测及预期结果。
9楼2015-12-16 09:15:10
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stone2239

实习版主

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【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by crab1983 at 2016-03-11 15:18:01
用blastx怎么能看出我的序列是不是完整的ORF呀。...

看你cDNA序列比对区域和匹配上的蛋白序列比对区域,举个例子,你的cDNA长度是1100bp,比对上的区域是100-1000bp,与数据库里某全长为300aa的蛋白的1-300匹配上了,那说明你的序列是包括完整的ORF。如果与数据库里某全长为400aa的蛋白的100-400aa匹配上了,那说明你的序列ORF缺少5'端。
17楼2016-03-11 21:06:39
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普通回帖

crab1983

主管区长

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

引用回帖:
2楼: Originally posted by jianguochen at 2015-12-14 18:39:54
主要还是看你扩增出来的序列用于做什么,表达的话可以分析下你的序列里共有多少个开放阅读框,哪个阅读框是你的序列。再根据ORF序列从起始密码子到终止密码子设计引物扩就是了。

我就是要这个基因克隆出来,然后转到拟南芥里面,鉴定一下。该怎么做呀?

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4楼2015-12-15 17:51:01
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crab1983

超级版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

引用回帖:
3楼: Originally posted by stone2239 at 2015-12-15 11:48:44
先用你的序列做blastx,看是否含有完整ORF,看编码区的具体位置,然后再根据你的需要设计引物,做定量的话,不需要有完整ORF,但是如果做表达研究功能,那需要有完整ORF,如没有,就做RACE扩全长。

我要转到拟南芥中,转到拟南芥里面主要鉴定一下这个基因。也就是得在拟南芥里表达

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5楼2015-12-15 17:52:44
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star013

实习版主

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做race的,可以过的基因全长,无论是定量还是表达,都可以用了,我们可以做race

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6楼2015-12-15 19:20:42
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fakirheart

兑换贵宾

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引用回帖:
4楼: Originally posted by crab1983 at 2015-12-15 17:51:01
我就是要这个基因克隆出来,然后转到拟南芥里面,鉴定一下。该怎么做呀?
...

那你这个工作量大呀,还得连接表达载体

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我是读书人
7楼2015-12-15 21:25:12
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crab1983

专家顾问

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引用回帖:
9楼: Originally posted by jianguochen at 2015-12-16 09:15:10
转到拟南芥里做表达的话,就扩增完整的ORF,需要的话,加上酶切位点用于后面的载体连接。转拟南芥的话你们实验室要是有这方面的经验就没什么难度,没有的话可以考虑送公司,很快的。还有就是你这个基因的功能是什么 ...

我这个基因是植物光合作用过程中的酶,理论上转到拟南芥中应该能提高拟南芥的光合速率。
10楼2016-02-23 10:25:15
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