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ELISA提高抗原抗体特异性结合 已有1人参与
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请教各位大神！ 我最近在做ELISA，先在酶标板包被抗原，然后加入少量能够和抗原特异性结合的酶标抗体（按理论计算抗原摩尔量远大于酶标抗体），发现就算是怎么增大包被抗原量，酶标抗体（始终定量）最多只能减少30%（通过测反应前后OD值确定），感觉抗原饱和了，为什么会出现这种情况？我想至少结合60%，该怎么做？我只有5金币了，各位大神帮忙分析一下。感激不尽！！！ |
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2楼2015-12-06 10:22:31
3楼2015-12-06 20:15:09
yyy0305
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
cgkbhf: 金币+5, ★★★很有帮助, 有帮助，谢谢了！！ 2015-12-08 19:05:02
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不知道题主设计这个实验的目的是什么？是进行抗体的定量还是进行抗原和抗体结合活性的测量？ 看样子像是想进行抗原抗体结合活性的测量，这个实验的设计方案应该是包被少量的抗原，抗体做梯度稀释，然后OD值进行四参数拟合，理论上在抗体浓度较高时几个点，信号会在平台期，后面会随浓度下降，抗体的信号也会下降，结合60%的点这个时候是能找到的。 抗原要是过量包被的话，定量的抗体都结合上去了，信号当然不会有太大变化。 注意OD值读数一般仪器的检测极限在3.5-4之间，如果信号在这个范围内，信号值可能就不在线性范围了，信号不可信，也就是说信号不能真实反馈结合的强弱了 |
4楼2015-12-06 21:02:49
5楼2015-12-06 22:03:05
yyy0305
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【答案】应助回帖
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固定在酶标板上的是抗体？一般固定在酶标板上的物质，只有10-15%是有活力的，这个见附件。随着抗原的量增加，如果信号到了平台期就说明抗体已经完全结合上了，不知道题主30%是怎么得出来的 |
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2015-12-06 22:50:51, 171.12 K
6楼2015-12-06 22:51:02
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可能我表述不太清楚，我的实验步揍是这样的： 1 包被抗原 2 封闭特异性结合位点 3 加入200ul酶标抗体，（加入前已测过OD值） 4 反应后将溶液吸出，测OD值，与加入前的OD做对比，分析酶标抗体被抗原结合多少 5 清洗板孔，加入显色液，终止液，测板孔OD值。验证酶标抗体减少量对应OD值是否与板孔增加OD值一致。 6 增大包被抗原量，仍加入200ul同等浓度的酶标抗体，（目的是将这定量酶标抗体全部被抗原结合）测反应前后酶标抗体的减少。 7 将溶液吸出，清洗板孔，加入200ul 更大浓度酶标抗体，看板孔OD值是否增加。 问题：不断增大包被抗原量，200ul酶标抗体反应后只能被抗原结合30%（通过测反应前后OD值，与标线对比，反应前后酶标抗体浓度减少30%） 但是在加入更大浓度的酶标抗体后，板孔OD值仍在增加，说明仍有未被占据的抗原结合位点，为什么在低浓度的酶标抗体溶液中，该位点不能结合抗体。是达到动态平衡了吗？ |
7楼2015-12-07 22:50:01
yyy0305
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【答案】应助回帖
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我知道你的实验过程了，但是我还是没弄清楚你的实验目的。有几点可以讨论一下1.拿酶标抗体减少的OD值和显色的OD值比较是没有意义的。具体请查看朗伯比尔定律。他们有不同的吸光系数。2.如果需要抗原全部占据，你包被的抗原必须是少量的，请根据抗原和酶联抗体的摩尔分子量进行计算，而且是远远少量的1:10左右，这样应该有平台期出现，酶联不同加入浓度实验，请同时做，这样好找平台期 发自小木虫Android客户端 |
8楼2015-12-08 07:50:22
9楼2015-12-08 10:02:36
yyy0305
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10楼2015-12-08 12:05:31
