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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 抗体/Elisa » ELISA提高抗原抗体特异性结合
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cgkbhf

新虫 (初入文坛)

[求助] ELISA提高抗原抗体特异性结合 已有1人参与

请教各位大神！
我最近在做ELISA，先在酶标板包被抗原，然后加入少量能够和抗原特异性结合的酶标抗体（按理论计算抗原摩尔量远大于酶标抗体），发现就算是怎么增大包被抗原量，酶标抗体（始终定量）最多只能减少30%（通过测反应前后OD值确定），感觉抗原饱和了，为什么会出现这种情况？我想至少结合60%，该怎么做？我只有5金币了，各位大神帮忙分析一下。感激不尽！！！
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1楼 2015-12-04 21:56:33
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北国佳人

铜虫 (小有名气)
应该在酶标板，抗原上找找原因，，能找出方法测试抗原包被的情况吗
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努力的小蜜蜂
2楼2015-12-06 10:22:31
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普通回帖

cgkbhf

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 北国佳人 at 2015-12-06 10:22:31
应该在酶标板，抗原上找找原因，，能找出方法测试抗原包被的情况吗

我之后在实验过后的板子上继续加入更大浓度的酶标抗体反应1h，后测酶标抗体反应前后的OD值，抗体有减少，而且测酶标孔OD值也有增加，我觉得我包被的抗原确实增加了，但是现在我需要将较低浓度的酶标抗体与包被抗原结合，发现增加包被抗原，酶标抗体到一定程度不减少。
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3楼2015-12-06 20:15:09
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yyy0305

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cgkbhf: 金币+5, ★★★很有帮助, 有帮助，谢谢了！！ 2015-12-08 19:05:02
不知道题主设计这个实验的目的是什么？是进行抗体的定量还是进行抗原和抗体结合活性的测量？
看样子像是想进行抗原抗体结合活性的测量，这个实验的设计方案应该是包被少量的抗原，抗体做梯度稀释，然后OD值进行四参数拟合，理论上在抗体浓度较高时几个点，信号会在平台期，后面会随浓度下降，抗体的信号也会下降，结合60%的点这个时候是能找到的。
抗原要是过量包被的话，定量的抗体都结合上去了，信号当然不会有太大变化。

注意OD值读数一般仪器的检测极限在3.5-4之间，如果信号在这个范围内，信号值可能就不在线性范围了，信号不可信，也就是说信号不能真实反馈结合的强弱了
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4楼2015-12-06 21:02:49
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cgkbhf

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yyy0305 at 2015-12-06 21:02:49
不知道题主设计这个实验的目的是什么？是进行抗体的定量还是进行抗原和抗体结合活性的测量？
看样子像是想进行抗原抗体结合活性的测量，这个实验的设计方案应该是包被少量的抗原，抗体做梯度稀释，然后OD值进行四参 ...

非常感谢您的回答，这是我实验的一部分，出了点问题。我现在的问题是要固定量酶标抗体全部被抗原结合，我在找抗原的量（抗体的量是不能变的），所以我设置了不同抗原浓度梯度去和这固定量的抗体反应，但是不管怎么增加抗原量，只能结合这定量抗体的30%，不能够全部结合。请问这是怎么回事？
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5楼2015-12-06 22:03:05
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yyy0305

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by cgkbhf at 2015-12-06 22:03:05
非常感谢您的回答，这是我实验的一部分，出了点问题。我现在的问题是要固定量酶标抗体全部被抗原结合，我在找抗原的量（抗体的量是不能变的），所以我设置了不同抗原浓度梯度去和这固定量的抗体反应，但是不管怎么 ...

固定在酶标板上的是抗体？一般固定在酶标板上的物质，只有10-15%是有活力的，这个见附件。随着抗原的量增加，如果信号到了平台期就说明抗体已经完全结合上了，不知道题主30%是怎么得出来的
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    • 2015-12-06 22:50:51, 171.12 K
6楼2015-12-06 22:51:02
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cgkbhf

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yyy0305 at 2015-12-06 22:51:02
固定在酶标板上的是抗体？一般固定在酶标板上的物质，只有10-15%是有活力的，这个见附件。随着抗原的量增加，如果信号到了平台期就说明抗体已经完全结合上了，不知道题主30%是怎么得出来的...

可能我表述不太清楚，我的实验步揍是这样的：
1 包被抗原
2 封闭特异性结合位点
3 加入200ul酶标抗体，（加入前已测过OD值）
4 反应后将溶液吸出，测OD值，与加入前的OD做对比，分析酶标抗体被抗原结合多少
5 清洗板孔，加入显色液，终止液，测板孔OD值。验证酶标抗体减少量对应OD值是否与板孔增加OD值一致。
6 增大包被抗原量，仍加入200ul同等浓度的酶标抗体，（目的是将这定量酶标抗体全部被抗原结合）测反应前后酶标抗体的减少。
7 将溶液吸出，清洗板孔，加入200ul 更大浓度酶标抗体，看板孔OD值是否增加。
问题：不断增大包被抗原量，200ul酶标抗体反应后只能被抗原结合30%（通过测反应前后OD值，与标线对比，反应前后酶标抗体浓度减少30%）
但是在加入更大浓度的酶标抗体后，板孔OD值仍在增加，说明仍有未被占据的抗原结合位点，为什么在低浓度的酶标抗体溶液中，该位点不能结合抗体。是达到动态平衡了吗？
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7楼2015-12-07 22:50:01
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yyy0305

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

我知道你的实验过程了，但是我还是没弄清楚你的实验目的。有几点可以讨论一下1.拿酶标抗体减少的OD值和显色的OD值比较是没有意义的。具体请查看朗伯比尔定律。他们有不同的吸光系数。2.如果需要抗原全部占据，你包被的抗原必须是少量的，请根据抗原和酶联抗体的摩尔分子量进行计算，而且是远远少量的1:10左右，这样应该有平台期出现，酶联不同加入浓度实验，请同时做，这样好找平台期

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8楼2015-12-08 07:50:22
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cgkbhf

新虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by yyy0305 at 2015-12-08 07:50:22
我知道你的实验过程了，但是我还是没弄清楚你的实验目的。有几点可以讨论一下1.拿酶标抗体减少的OD值和显色的OD值比较是没有意义的。具体请查看朗伯比尔定律。他们有不同的吸光系数。2.如果需要抗原全部占据，你包被 ...

我的目的是找到能够将200ul酶标抗体（浓度稀释10E5）全部结合掉的抗原量，但是发现不管怎么增加包被抗原量都没法将加入的抗体全部结合。我不需要考虑抗原是否全被占据，只要抗体全被结合就行了。
Ag+Ab=Ag*Ab  Ab的量固定不变，找出方法能够将Ab全部转化或者大部分转化为Ag*Ab
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9楼2015-12-08 10:02:36
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yyy0305

至尊木虫 (著名写手)
抗原抗体反应是可逆的，会最后形成动态平衡，如果抗原过量不行的话，你只有抗体少量了，酶联抗体的稀释倍数你看能不能调整

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10楼2015-12-08 12:05:31
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