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cgkbhf

新虫 (初入文坛)

[求助] ELISA提高抗原抗体特异性结合 已有1人参与

请教各位大神!
我最近在做ELISA,先在酶标板包被抗原,然后加入少量能够和抗原特异性结合的酶标抗体(按理论计算抗原摩尔量远大于酶标抗体),发现就算是怎么增大包被抗原量,酶标抗体(始终定量)最多只能减少30%(通过测反应前后OD值确定),感觉抗原饱和了,为什么会出现这种情况?我想至少结合60%,该怎么做?我只有5金币了,各位大神帮忙分析一下。感激不尽!!!
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cgkbhf

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by yyy0305 at 2015-12-08 07:50:22
我知道你的实验过程了,但是我还是没弄清楚你的实验目的。有几点可以讨论一下1.拿酶标抗体减少的OD值和显色的OD值比较是没有意义的。具体请查看朗伯比尔定律。他们有不同的吸光系数。2.如果需要抗原全部占据,你包被 ...

我的目的是找到能够将200ul酶标抗体(浓度稀释10E5)全部结合掉的抗原量,但是发现不管怎么增加包被抗原量都没法将加入的抗体全部结合。我不需要考虑抗原是否全被占据,只要抗体全被结合就行了。
Ag+Ab=Ag*Ab  Ab的量固定不变,找出方法能够将Ab全部转化或者大部分转化为Ag*Ab
9楼2015-12-08 10:02:36
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查看全部 11 个回答

北国佳人

铜虫 (小有名气)

应该在酶标板,抗原上找找原因,,能找出方法测试抗原包被的情况吗
努力的小蜜蜂
2楼2015-12-06 10:22:31
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cgkbhf

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 北国佳人 at 2015-12-06 10:22:31
应该在酶标板,抗原上找找原因,,能找出方法测试抗原包被的情况吗

我之后在实验过后的板子上继续加入更大浓度的酶标抗体反应1h,后测酶标抗体反应前后的OD值,抗体有减少,而且测酶标孔OD值也有增加,我觉得我包被的抗原确实增加了,但是现在我需要将较低浓度的酶标抗体与包被抗原结合,发现增加包被抗原,酶标抗体到一定程度不减少。
3楼2015-12-06 20:15:09
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yyy0305

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
cgkbhf: 金币+5, ★★★很有帮助, 有帮助,谢谢了!! 2015-12-08 19:05:02
不知道题主设计这个实验的目的是什么?是进行抗体的定量还是进行抗原和抗体结合活性的测量?
看样子像是想进行抗原抗体结合活性的测量,这个实验的设计方案应该是包被少量的抗原,抗体做梯度稀释,然后OD值进行四参数拟合,理论上在抗体浓度较高时几个点,信号会在平台期,后面会随浓度下降,抗体的信号也会下降,结合60%的点这个时候是能找到的。
抗原要是过量包被的话,定量的抗体都结合上去了,信号当然不会有太大变化。

注意OD值读数一般仪器的检测极限在3.5-4之间,如果信号在这个范围内,信号值可能就不在线性范围了,信号不可信,也就是说信号不能真实反馈结合的强弱了
4楼2015-12-06 21:02:49
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