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HPLC纯化蛋白质 已有8人参与
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已经记不得课堂上关于HPLC的知识是哪位老师讲的了，或许那时她给讲睡着了，所以，错过的知识点，实验课堂上被屏蔽的信号，总是一片空白。 然而，重新走进HPLC，连不上记忆，更谈不上温故而知新，只得重新查找各种资料，本文详细的简述了HPLC的定义、分离模式、种类，供没有背景知识的读者参考。 我相信，离开课堂的你，总会和我一样，慢慢地找到未来自己想要抓住的知识，并细细钻研。 ——可以重拾课堂上的知识，只是时光再也回不去 色谱法最早应用于植物色素的分离，1906年俄国植物学家茨维特用碳酸钙作为固定相填充竖立的玻璃管，植物色素的提取液流经固定相，经过石油醚进行洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中由一条色带分散为数条平行的色带，色谱法(Chromatography)因之得名。 经典的液相色谱法开始阶段是在室温和常压下，在大直径的玻璃管柱内利用液位差输送流动相，此方法柱效低、时间长。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是固定相填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，以高压驱动输送流动相，分离工作在几个小时甚至几十分钟内完成，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)，又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。 高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)利用不同蛋白质的分子量大小、形状、带电荷性质、疏水性、亲和性不同来分离检测蛋白质的技术。溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（配基亲和性吸附、不同物质在不同相态的选择性分配、离子间吸引作用、分子量排阻）的大小、强弱不同，以不同的速度流经固定相，最终达到分离蛋白的作用，又称为色层法、层析法。在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 HPLC由液体输送系统、进样系统、色谱柱和检测系统4部分所组成。 输液泵将流动相样品以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，通过进样品导入色谱柱，在色谱柱中各组分依照分配系数、吸附力大小、带电性质、疏水性、亲和性以及蛋白质的分子量大小的差异而被分离，并依次随流动相流至检测器，将检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存，目前HPLC技术广泛的应用于蛋白质的分离和检测。根据蛋白质在物理、化学及功能上的差异选择不同的HPLC分离模式来分离目标蛋白，常见的分离模式有： 反相高效液相色谱 （reversephasehigh-perfor-manceliquidchromatography，RP—HPLC） 在HPLC 各种模式中，RP - HPLC 应用最为广泛。蛋白质分子混合物在RP – HPLC模式系统中因其极性的差异而分离，且蛋白质分子因其疏水性的不同在两相中的分配也不同。一般其固定相是非极性的（如C18、C8），而流动相是比固定相极性更强的溶剂系统，流动相一般为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。 当使用RP-HPLC进行蛋白质分离时，一般需要低pH 值流动相，室温或较高的温度及使用乙腈或异丙醇作为有机部分，另外，三氟乙酸( TFA)是反相色谱中最常用的离子对试剂。常用缓冲液控制流动相的pH值，但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。因为蛋白质通常具有强极性，所以蛋白质的保留性质和选择性还与键合固定相的性质有关，蛋白质与C18的结合较困难，实验表明，大孔硅胶(20～30 nm) 短链烷基(C4 和C8) 键合固定相适合蛋白质的分离。 高效亲和色谱 （highperformanceaffinitychro-matography，HPAFC） 蛋白质与层析载体上固相化的配体之间通过共价键、范德华力、疏水力、静电力等作用发生生物学专一性结合，链接在载体表面的功能团配体上，能与特异性蛋白质大分子发生亲和作用的基团如酶的作用底物，辅酶，激素受体，抗原与抗体的结合，这种高度专一性结合特性可用于亲和色谱分离。HPAFC 是蛋白质检测中最专一的分离技术,可以从复杂的混合物中直接分离到目标蛋白质，特别适合疫苗、糖蛋白和抗体等的分离纯化 高效离子交换色谱 （highperformanceionex-changechromatography，HPIEC） HPIEC是以离子交换剂为固定相，常见的离子交换剂是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质共价结合某种电荷基团，形成带基质，平衡离子可以通过静电力作用结合在电荷基质上，样品流动相中的离子可与平衡离子进行可逆交换而吸附在电荷基质上。离子交换色谱是根据蛋白质分子在一定的pH 和离子强度条件下所带电荷和固定相上的离子间结合力的差别而进行分离的一种层析方法。近几年来HPIEC 也成为分离检测蛋白质的重要方法。 高效凝胶过滤色谱 （highperformancesizeexclu-sionchromatography，HPSEC） 凝胶过滤色谱也称体积排阻色谱(Size exclusion chromatography ,SEC) , 是根据蛋白相对分子大小进行分离的一种色谱技术。固定相具有分子筛的作用，流动相为样品溶液，当不同分子大小的样品同时流经凝胶层析柱时，比孔穴孔径大的分子不能进入到凝胶孔内部，被排阻在孔外，随流动相向下流动，最先流出柱子；而较小的分子渗透进入凝胶孔内部，流动速度慢，路程长，最后流出；而分子大小介于两者之间的样品在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，流出时间介于两者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。相对于吸附性液相色谱技术而言，SEC 的分辨力和上样体积都有限。 知识天空 知识的确是天空中伟大的太阳,它那万道光芒投下了生命,投下了力量 ——-丹•伯斯特 最熟悉的培根名言，知识就是力量，期待每个人都能抓住自己想要钻研的知识，转化为独特的力量。 |
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2015-11-26 08:58:19, 140.88 K
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