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新虫 (小有名气)

[求助] 目的条带跑不开,是怎么了???

我在做植物的内生真菌,我先简单说下,我提了植物总的DNA,用真菌通用引物ITS1F-ITS4跑的pcr,目的是扩增总DNA里边的真菌序列,一般目的条带是在500-750bp之间,根据文献,这个通用引物会同时扩增出植物的序列,但是扩增出来的植物序列都会比真菌的长。
目前我遇到的问题是:我能扩增出多条带,但是条带跑不开,或者说跑的不是很开,不知道怎么办?因为我还要切胶回收,做蓝白斑筛选,这样难度就很大。我用了5ulpcr产物跑的胶,会不会是产物点样太多,还是我的pcr循环了35次,太多了吗?我只想让这些条带分的清晰点,不要太多融合,另外我每次跑的条带都不直,我做胶已经很按要求了,是不是我点样的技术问题,还是电泳液要换新的?这三张图是我在调试不同退火温度的

目的条带跑不开,是怎么了???


目的条带跑不开,是怎么了???-1


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新虫 (小有名气)

maker是点太多了,所以没跑开,1%左右的胶,120V电压

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3楼2015-11-03 20:22:39
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新虫 (小有名气)

我想跑的开点,跑了30_40分钟,可是还是不行

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4楼2015-11-03 20:23:39
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新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gilinflying at 2015-11-03 20:19:50
marker都没跑开。。胶什么浓度啊?跑了多久啊?

会不会是我点的样太多了

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5楼2015-11-03 20:23:58
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新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by gilinflying at 2015-11-03 20:30:07
样品点样可以少点。但是marker没跑开,胶的浓度是多少?

胶1.2%

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7楼2015-11-03 20:30:39
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新虫 (小有名气)

9楼2015-11-03 23:06:41
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新虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by biostar2009 at 2015-11-03 23:08:17
你已经发现问题了,同理没跑开为什么没想到你的样品DNA也太多了?克隆为目的的根本不需要这么多。如果主带明显多于其他条带,全部直接克隆,挑出你想要的大小也相当容易。
...

嗯,明天我再试下,之所以要点样多是因为我做植物内生真菌的多样性,最后要用50ul体系跑,然后切胶回收,如果点样少会不会对多样性结果有影响?

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13楼2015-11-03 23:52:51
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引用回帖:
15楼: Originally posted by biostar2009 at 2015-11-04 00:01:24
多样性和最终亮度并无直接关系,很亮可以只有一种分子,看不见的一条DNA里面可能每条DNA都不相同。没逻辑。相反,是通过PCR扩增得到的库,保留多样性的第一原则就是尽量少循环,以减少扩增偏差和同质化!
...

谢谢

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16楼2015-11-04 09:01:33
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送红花一朵
引用回帖:
14楼: Originally posted by liweiwaxmc at 2015-11-03 23:59:07
凝胶分离就像筛子一样!如果筛子分不开东西!只要你的样品没有太大问题!一般都会调整筛子孔径大小!可以调整胶浓度看看!

谢谢

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17楼2015-11-04 09:01:54
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新虫 (小有名气)

引用回帖:
18楼: Originally posted by 潘潘0227 at 2015-11-04 09:29:44
电压变小,延长时间,胶浓度提高试试。

嗯,正在pcr,马上试

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19楼2015-11-04 13:17:34
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