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lchxs465

禁虫 (初入文坛)

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足下客

木虫 (正式写手)

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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-11-03 22:59:42
lchxs465: 金币+5 2015-11-04 17:43:54
lchxs465: 金币+5 2015-11-04 17:45:02
1. 你的目的基因条带酶切完回收后条带亮度如何?连接体系中加入目的基因的量一般要看回收后的亮度决定,我以前一般用4:1的比例就可以连上。
2. 你选的是哪两个酶切位点,最好选粘性末端的,平末端的很难连。再者有些酶切位点本身就不好连,尽量选常见的酶切位点,像HindIII,EcorI之类的,都好连。
3. 你要确认你的载体是已经切开的,如果没有切开,自然是连不上的,这个酶切完后可以跑电泳确认一下。
3楼2015-11-03 13:19:04
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wxb2061

银虫 (小有名气)

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-11-03 22:59:59
空载的载体酶切真心不好确认,我得是ndel和hindlll位点,跑胶根本看不到,现在正在做,前一次就是连不上,菌落都是一丁点的样子,一看就不是连接上的菌,我转化是dh5a,同样28a载体。下午转化,自求多福啊!

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走在途中……
4楼2015-11-03 14:31:28
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keke226

铁杆木虫 (正式写手)

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-11-03 23:00:18
lchxs465: 金币+5 2015-11-04 17:45:25
载体自连太多的话可以在酶切后用碱性磷酸酶处理一下,降低连接时载体的自连率。另外,为了确认载体是否完全被切开了,可以把酶切后的载体做一次转化做个对照即可。

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读书廿年倦写字,如今翻书不识志,若知眷书悔前程,无如渔樵未识时。三年担柴熟山性,三年苦网谙水汹,前程在心自倦舒,识志何用书中清。
8楼2015-11-03 16:27:38
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w_goodluck

铜虫 (小有名气)


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楼上说的都是挺好的。看楼主应该是被困扰时间挺长了,说明做了不少次。有些特殊情况下,某些片段的确很难和载体连接,我们做实验时候碰到过多次。比较好的解决办法是,在转化平板上长出来的菌落,用菌落PCR来筛选阳性菌落,做好一次筛选上四五十个,做上一两次就可以筛选到了。

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13楼2015-11-04 08:36:50
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djbitter

新虫 (小有名气)

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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-11-03 22:59:25
可能不能用蓝白斑,印象中宿主菌为BL21,本身可变蓝;片段与载体合适连接比,可同时用几种比例;片段、载体量与纯度;如果自连率高,是否载体双酶切效率低。
2楼2015-11-03 11:38:26
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lchxs465

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5楼2015-11-03 15:51:05
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lchxs465

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6楼2015-11-03 15:51:39
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7楼2015-11-03 15:52:45
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quiller2000

木虫 (著名写手)

基本上是自连
致良知
9楼2015-11-03 16:54:26
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陈爱中

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-11-03 23:00:36
lchxs465: 金币+5 2015-11-04 17:45:57
双酶切没切好,可能只是发生单酶切了,自连概率增大。载体和目的片段都换双酶切条件吧,不知道换什么就一个酶切好换另一个酶切。这个载体好做的,我以前做过,不会有那么多自连,是你没切好。
10楼2015-11-03 22:44:06
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