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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pet-28a载体空载问题怎么解决？？
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lchxs465

禁虫 (初入文坛)
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1楼 2015-11-03 10:24:01
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足下客

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-11-03 22:59:42
lchxs465: 金币+5 2015-11-04 17:43:54
lchxs465: 金币+5 2015-11-04 17:45:02
1. 你的目的基因条带酶切完回收后条带亮度如何？连接体系中加入目的基因的量一般要看回收后的亮度决定，我以前一般用4:1的比例就可以连上。
2. 你选的是哪两个酶切位点，最好选粘性末端的，平末端的很难连。再者有些酶切位点本身就不好连，尽量选常见的酶切位点，像HindIII，EcorI之类的，都好连。
3. 你要确认你的载体是已经切开的，如果没有切开，自然是连不上的，这个酶切完后可以跑电泳确认一下。
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3楼2015-11-03 13:19:04
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wxb2061

银虫 (小有名气)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-11-03 22:59:59
空载的载体酶切真心不好确认，我得是ndel和hindlll位点，跑胶根本看不到，现在正在做，前一次就是连不上，菌落都是一丁点的样子，一看就不是连接上的菌，我转化是dh5a，同样28a载体。下午转化，自求多福啊！

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走在途中……
4楼2015-11-03 14:31:28
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keke226

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-11-03 23:00:18
lchxs465: 金币+5 2015-11-04 17:45:25
载体自连太多的话可以在酶切后用碱性磷酸酶处理一下，降低连接时载体的自连率。另外，为了确认载体是否完全被切开了，可以把酶切后的载体做一次转化做个对照即可。

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读书廿年倦写字，如今翻书不识志，若知眷书悔前程，无如渔樵未识时。三年担柴熟山性，三年苦网谙水汹，前程在心自倦舒，识志何用书中清。
8楼2015-11-03 16:27:38
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w_goodluck

铜虫 (小有名气)
★
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楼上说的都是挺好的。看楼主应该是被困扰时间挺长了，说明做了不少次。有些特殊情况下，某些片段的确很难和载体连接，我们做实验时候碰到过多次。比较好的解决办法是，在转化平板上长出来的菌落，用菌落PCR来筛选阳性菌落，做好一次筛选上四五十个，做上一两次就可以筛选到了。

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13楼2015-11-04 08:36:50
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djbitter

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-11-03 22:59:25
可能不能用蓝白斑，印象中宿主菌为BL21，本身可变蓝;片段与载体合适连接比，可同时用几种比例;片段、载体量与纯度;如果自连率高，是否载体双酶切效率低。
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2楼2015-11-03 11:38:26
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lchxs465

禁虫 (初入文坛)
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5楼2015-11-03 15:51:05
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lchxs465

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6楼2015-11-03 15:51:39
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7楼2015-11-03 15:52:45
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quiller2000

木虫 (著名写手)
基本上是自连
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致良知
9楼2015-11-03 16:54:26
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陈爱中

新虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-11-03 23:00:36
lchxs465: 金币+5 2015-11-04 17:45:57
双酶切没切好，可能只是发生单酶切了，自连概率增大。载体和目的片段都换双酶切条件吧，不知道换什么就一个酶切好换另一个酶切。这个载体好做的，我以前做过，不会有那么多自连，是你没切好。
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10楼2015-11-03 22:44:06
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