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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pet-28a载体空载问题怎么解决？？
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1045344165

金虫 (正式写手)
额(⊙o⊙)…

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11楼2015-11-03 23:05:22
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bright8

铁杆木虫 (著名写手)
★
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双酶切没有切好,只要质粒切好,就能链接上了，另外片段:载体=7:1,空载会少一些。

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12楼2015-11-04 07:35:14
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w_goodluck

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼上说的都是挺好的。看楼主应该是被困扰时间挺长了，说明做了不少次。有些特殊情况下，某些片段的确很难和载体连接，我们做实验时候碰到过多次。比较好的解决办法是，在转化平板上长出来的菌落，用菌落PCR来筛选阳性菌落，做好一次筛选上四五十个，做上一两次就可以筛选到了。

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13楼2015-11-04 08:36:50
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xuweitao

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by keke226 at 2015-11-03 16:27:38
载体自连太多的话可以在酶切后用碱性磷酸酶处理一下，降低连接时载体的自连率。另外，为了确认载体是否完全被切开了，可以把酶切后的载体做一次转化做个对照即可。
...

正解也！
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14楼2015-11-06 11:21:51
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maxiaoliangx

铜虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
4楼: Originally posted by wxb2061 at 2015-11-03 14:31:28
空载的载体酶切真心不好确认，我得是ndel和hindlll位点，跑胶根本看不到，现在正在做，前一次就是连不上，菌落都是一丁点的样子，一看就不是连接上的菌，我转化是dh5a，同样28a载体。下午转化，自求多福啊！
...

额···   这个，你是怎么通过菌落看出来有没有连上菌的？是因为菌落长得少么？我昨天做个转化，今天早上看板子上菌落就特别少，这种情况是要废么？
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15楼2015-11-22 09:40:23
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