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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » qpcr实验复孔后的问题
汕头大学海洋科学接受调剂
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a13515517892

木虫 (小有名气)

[交流] qpcr实验复孔后的问题 已有8人参与

做细胞水平的验证时，发生了很诡异的结果，就是我的目的基因都P出来，并且重现性和复孔之间的差距都很小，但是内参基因GAPDH确很不稳定，复孔之间会差5个以上的Ct值，我做了8次了，每次都不一样，而且差距都很大，复孔之间始终存在很大的差异，以前做组织时都没有这种现象，但是GAPDH的溶解曲线峰值很好，都是83.5,而且没有杂峰。我为了防止可能是自己操作的误差，把所有Mix和模板，引物都加在一个管子里混匀了，在分到不同的PCR管中，可是复孔之间还是差距很大。我做了4个复孔，有3个复孔的Ct12，有1个复孔是4。跑胶的结果是12和4的复孔的亮度没什么区别，你觉得可能是什么原因呢？

组织和细胞水平一起做的时候，组织中的GAPDH都很正常，复孔之间没有什么差距，就是细胞特别不稳定。
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1楼 2015-10-25 15:21:23
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444565008qq

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我只想问一下，你的重复直接差异小怎么做到的，我的重复直接有大有小，很不稳定
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2楼2015-10-25 19:52:00
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Anew365
顶

发自小木虫Android客户端
3楼2015-10-25 21:43:25
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懒蛋

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你的gapdh ct太低了，稀释一下，让他维持在15-18，浓度太高了ct 会不稳定

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向钱看，向厚赚
4楼2015-10-25 23:51:39
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懒蛋

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
其实有三个重复都是12，那4那个重复就可以不算了，要那么多重复你老板不心疼？

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向钱看，向厚赚
5楼2015-10-25 23:53:43
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sankok

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
浓度太高加上仪器感光问题

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6楼2015-10-26 00:44:56
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1992wuyan

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你的Ct值都太小了，那么小已经不稳定了，12和4应该都是不准确的，需要稀释模板，将Ct值变大再算
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7楼2015-10-26 10:43:04
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zhuguiqiu

禁虫 (文坛精英)
本帖内容被屏蔽
8楼2015-10-26 11:28:49
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足下客

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你这个内参基因的Ct值太靠前了吧，一般内参的Ct值要在20几啊，建议你把内参至少稀释1000倍试一下。估计是在细胞水平中，这个内参基因的浓度太高了，Ct值太小，就是很不稳定。
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9楼2015-10-27 16:48:03
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happyboy_34

木虫 (著名写手)

…ing
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
来学习的。
从回复看，再加上以前做qPCR的经验，应该就是内参Ct值太低/浓度太高/表达量太高 的缘故了。
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真理无处不在，但却非唾手可得。
10楼2015-10-29 09:36:34
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