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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 高保真酶扩出目的基因后，如何高效加尾（最好提供加尾体系）
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如果如愿

新虫 (初入文坛)

[求助] 高保真酶扩出目的基因后，如何高效加尾（最好提供加尾体系） 已有1人参与

最近用用高保真酶扩增目的片段，然后加A，但是一直连接不上T载体，都快急死了，求各位大神帮忙！（希望提供加尾体系），谢谢了
我的具体做法是：高保真酶（全式金公司）扩增后，跑电泳，琼脂糖凝胶回收，回收后用takara公司的Taq酶加尾，然后采用两种方法回收，一种方法是跑电泳，凝胶回收，另一种方法直接纯化，这两种方法我都做过，但是都不出结果连接不上。
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1楼 2015-10-22 16:07:59
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tolobio

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
nono2009: 金币-20, 屏蔽内容, 违规存档, 禁止回帖广告 2015-10-25 10:05:42
本帖内容被屏蔽
2楼2015-10-22 16:29:07
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
如果如愿: 金币+4, ★★★很有帮助 2015-10-24 10:38:00
如果如愿: 金币+1, ★★★很有帮助 2015-10-24 10:40:22
人品好的时候怎么连都连得上，不好的时候折腾死也连不上。。这是我的经验。

我人品差到爆的时候，选择用平端连接了，于是就连上了。虽然效率低很多，长出来的克隆数少，但是总是有的，阳性率也高。推荐你试试。

我把平端载体环化做成了plasmid，需要的话找我换或者购买。151354061
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3楼2015-10-23 03:29:04
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如果如愿

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2015-10-23 03:29:04
人品好的时候怎么连都连得上，不好的时候折腾死也连不上。。这是我的经验。

我人品差到爆的时候，选择用平端连接了，于是就连上了。虽然效率低很多，长出来的克隆数少，但是总是有的，阳性率也高。推荐你试试。
...

看来我人品也很差呀，你是用平末端的T载体吗？之前有个公司推荐我用，我没试过。
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4楼2015-10-23 11:19:47
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 如果如愿 at 2015-10-23 11:19:47
看来我人品也很差呀，你是用平末端的T载体吗？之前有个公司推荐我用，我没试过。...

是的，我用的fermentas的平末端连接试剂盒的试用装。后来发现买的话那个盒子挺贵的，就自己把剩下的载体加了几个碱基和酶切位点环化了~~然后用T4和PEG4000做的平端连接，虽然菌落特别少，但是几乎没失败过。还省事，不用+A了
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5楼2015-10-23 15:02:42
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狼王啊

铁虫 (初入文坛)
高保真扩增条带后，原体系中加一点点Taq酶混匀，72度30min,跑胶回收目的条带，连T载体。
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6楼2015-10-28 15:16:02
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75722428

新虫 (初入文坛)
帮顶！同问
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7楼2015-10-30 13:32:17
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宋宋6

新虫 (初入文坛)
我蓝白斑筛选，能长菌，长的还不少，菌液pcr就是没有目的带。。关键坑人的是引物居然能和载体序列匹配的差不多，快郁闷死了。。。。

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8楼2015-12-23 19:22:53
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