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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接产物转化后无阳性！求原因
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Gaory0906

新虫 (小有名气)

[求助] 连接产物转化后无阳性！求原因 已有3人参与

请大神指教一下我的问题。我的载体4微升转化，长出来两个菌落。我的连接产物（配连接体系时加入4微升的载体），转化后长出20个菌落。我觉得单纯转化载体是对照，连接产物长出这么多菌落肯定说明连接成功啊。结果，我做菌液pcr ，没有条带唉。。。。怎么回事，请大神指教！！
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搞死科研
1楼 2015-10-17 06:13:42
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匿名

用户注销 (著名写手)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-17 18:04:26
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2楼2015-10-17 06:51:37
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Gaory0906

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 弦山小栗 at 2015-10-17 06:51:37
要是确定没有问题，提个质粒做酶切试试，有时菌液pcr不一定准确，我们实验室是100ul感受态加10ul连接产物，涂板时是涂50ul就能长挺多菌的。感受态是dh5a,质粒是t载体。希望对你有帮助。
...

您感觉菌液PCR不一定准确？那拿质粒pcr是不是会好些？
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搞死科研
3楼2015-10-17 08:52:40
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wxb2061

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 弦山小栗 at 2015-10-17 06:51:37
要是确定没有问题，提个质粒做酶切试试，有时菌液pcr不一定准确，我们实验室是100ul感受态加10ul连接产物，涂板时是涂50ul就能长挺多菌的。感受态是dh5a,质粒是t载体。希望对你有帮助。
...

100ul?为什么这么多，我们是50ul，难道量多会更好吗

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走在途中……
4楼2015-10-17 10:12:30
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tolobio

新虫 (小有名气)
商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
菌落PCR用的还是比较多的，关键是比较方便。另外，质粒快抽也很方便。
如果PCR没有得到结果的话，可能的原因很多：引物问题，PCR体系问题。PCR的时候，有正负对照吗？正负对照很关键。感觉实验就是做好对照，然后就能找到问题关键，最后就是解决问题。希望有用。
需要快抽protocol的话，可以EMail我tolobio@126.com; support@tolobio.com
或者visit our website：http://www.tolobio.com/service_detail.php?id=110
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5楼2015-10-17 11:35:25
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jianguochen

新虫 (小有名气)
用这个阳参判断实验有点勉强，加入4ul线性载体的连接体系做转化比4ul的环状质粒转化效率高10倍，这个结果本身与预期是有冲突的，所以以此判断转化成功与否有待商榷。如果确实对转化结果有信心，可以将阳性提质粒，再用于PCR，或许是菌体或者质粒拷贝数比较低呢。
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6楼2015-10-17 22:22:08
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匿名

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7楼2015-10-18 09:02:02
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匿名

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8楼2015-10-18 09:04:31
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啦啦啦大胖子

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Gaory0906: 金币+4, ★★★很有帮助 2015-10-21 02:56:02
1.载体4微升转化，长出来两个菌落，这本身就说明感受态的转化效率不高，一般我们1微升的载体转化进100微升感受态中，就能长一满板的菌。而你载体转化对照只能说明你感受态没有问题，不能作为连接成功的对照说明。
2.菌落PCR没有条带，有可能是你连接没有成功，也有可能是菌落PCR本身的问题，如果你确信你连接成功了，可以抽质粒再跑，或者抽质粒酶切鉴定。

PS：我之前就遇到过菌落PCR没有，但我抽质粒跑PCR，酶切，送测序都是对的。
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9楼2015-10-18 09:42:37
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董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Gaory0906: 金币+6, ★★★★★最佳答案 2015-10-21 02:56:12
我今年3月11号发过一篇名为“DNA重组-载体构建常见问题及解决方法”的总结，包括各个过程出现的问题、可能的原因和解决办法
1)克隆基因的酶切位点问题  
2)目的片段的扩增
3) 载体酶切的问题  
4) 连接片段浓度比的问题  
5）菌液的提取
6）酶切鉴定
7）表达鉴定包括
您可以搜一下看看，相信一定对您有很大帮助
赞一下 回复此楼
医学&统计学
10楼2015-10-18 17:59:48
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