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Gaory0906

新虫 (小有名气)

[求助] 连接产物转化后无阳性!求原因 已有3人参与

请大神指教一下我的问题。我的载体4微升转化,长出来两个菌落。我的连接产物(配连接体系时加入4微升的载体),转化后长出20个菌落。我觉得单纯转化载体是对照,连接产物长出这么多菌落肯定说明连接成功啊。结果,我做菌液pcr ,没有条带唉。。。。怎么回事,请大神指教!!
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搞死科研
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啦啦啦大胖子

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
Gaory0906: 金币+4, ★★★很有帮助 2015-10-21 02:56:02
1.载体4微升转化,长出来两个菌落,这本身就说明感受态的转化效率不高,一般我们1微升的载体转化进100微升感受态中,就能长一满板的菌。而你载体转化对照只能说明你感受态没有问题,不能作为连接成功的对照说明。
2.菌落PCR没有条带,有可能是你连接没有成功,也有可能是菌落PCR本身的问题,如果你确信你连接成功了,可以抽质粒再跑,或者抽质粒酶切鉴定。

PS:我之前就遇到过菌落PCR没有,但我抽质粒跑PCR,酶切,送测序都是对的。
9楼2015-10-18 09:42:37
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查看全部 14 个回答

匿名

用户注销 (著名写手)



myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香,分子生物期待您更多精彩。 2015-10-17 18:04:26
本帖仅楼主可见
2楼2015-10-17 06:51:37
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Gaory0906

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 弦山小栗 at 2015-10-17 06:51:37
要是确定没有问题,提个质粒做酶切试试,有时菌液pcr不一定准确,我们实验室是100ul感受态加10ul连接产物,涂板时是涂50ul就能长挺多菌的。感受态是dh5a,质粒是t载体。希望对你有帮助。
...

您感觉菌液PCR不一定准确?那拿质粒pcr是不是会好些?
搞死科研
3楼2015-10-17 08:52:40
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wxb2061

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 弦山小栗 at 2015-10-17 06:51:37
要是确定没有问题,提个质粒做酶切试试,有时菌液pcr不一定准确,我们实验室是100ul感受态加10ul连接产物,涂板时是涂50ul就能长挺多菌的。感受态是dh5a,质粒是t载体。希望对你有帮助。
...

100ul?为什么这么多,我们是50ul,难道量多会更好吗

发自小木虫Android客户端
走在途中……
4楼2015-10-17 10:12:30
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