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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接产物转化后无阳性！求原因
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Gaory0906

新虫 (小有名气)

[求助] 连接产物转化后无阳性！求原因 已有3人参与

请大神指教一下我的问题。我的载体4微升转化，长出来两个菌落。我的连接产物（配连接体系时加入4微升的载体），转化后长出20个菌落。我觉得单纯转化载体是对照，连接产物长出这么多菌落肯定说明连接成功啊。结果，我做菌液pcr ，没有条带唉。。。。怎么回事，请大神指教！！
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搞死科研
1楼 2015-10-17 06:13:42
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啦啦啦大胖子

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Gaory0906: 金币+4, ★★★很有帮助 2015-10-21 02:56:02
1.载体4微升转化，长出来两个菌落，这本身就说明感受态的转化效率不高，一般我们1微升的载体转化进100微升感受态中，就能长一满板的菌。而你载体转化对照只能说明你感受态没有问题，不能作为连接成功的对照说明。
2.菌落PCR没有条带，有可能是你连接没有成功，也有可能是菌落PCR本身的问题，如果你确信你连接成功了，可以抽质粒再跑，或者抽质粒酶切鉴定。

PS：我之前就遇到过菌落PCR没有，但我抽质粒跑PCR，酶切，送测序都是对的。
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9楼2015-10-18 09:42:37
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匿名

用户注销 (著名写手)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-17 18:04:26
本帖仅楼主可见
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2楼2015-10-17 06:51:37
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Gaory0906

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 弦山小栗 at 2015-10-17 06:51:37
要是确定没有问题，提个质粒做酶切试试，有时菌液pcr不一定准确，我们实验室是100ul感受态加10ul连接产物，涂板时是涂50ul就能长挺多菌的。感受态是dh5a,质粒是t载体。希望对你有帮助。
...

您感觉菌液PCR不一定准确？那拿质粒pcr是不是会好些？
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搞死科研
3楼2015-10-17 08:52:40
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wxb2061

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 弦山小栗 at 2015-10-17 06:51:37
要是确定没有问题，提个质粒做酶切试试，有时菌液pcr不一定准确，我们实验室是100ul感受态加10ul连接产物，涂板时是涂50ul就能长挺多菌的。感受态是dh5a,质粒是t载体。希望对你有帮助。
...

100ul?为什么这么多，我们是50ul，难道量多会更好吗

发自小木虫Android客户端
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走在途中……
4楼2015-10-17 10:12:30
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