应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 连接产物转化后无阳性！求原因
141/2返回列表12下一页
查看: 2917  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

Gaory0906

新虫 (小有名气)

[求助] 连接产物转化后无阳性！求原因 已有3人参与

请大神指教一下我的问题。我的载体4微升转化，长出来两个菌落。我的连接产物（配连接体系时加入4微升的载体），转化后长出20个菌落。我觉得单纯转化载体是对照，连接产物长出这么多菌落肯定说明连接成功啊。结果，我做菌液pcr ，没有条带唉。。。。怎么回事，请大神指教！！
回复此楼

» 猜你喜欢
搞死科研
1楼 2015-10-17 06:13:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

匿名

用户注销 (著名写手)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-17 18:04:26
本帖仅楼主可见
赞一下
2楼2015-10-17 06:51:37
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页
普通回帖

Gaory0906

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 弦山小栗 at 2015-10-17 06:51:37
要是确定没有问题，提个质粒做酶切试试，有时菌液pcr不一定准确，我们实验室是100ul感受态加10ul连接产物，涂板时是涂50ul就能长挺多菌的。感受态是dh5a,质粒是t载体。希望对你有帮助。
...

您感觉菌液PCR不一定准确？那拿质粒pcr是不是会好些？
赞一下 回复此楼
搞死科研
3楼2015-10-17 08:52:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wxb2061

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 弦山小栗 at 2015-10-17 06:51:37
要是确定没有问题，提个质粒做酶切试试，有时菌液pcr不一定准确，我们实验室是100ul感受态加10ul连接产物，涂板时是涂50ul就能长挺多菌的。感受态是dh5a,质粒是t载体。希望对你有帮助。
...

100ul?为什么这么多，我们是50ul，难道量多会更好吗

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
走在途中……
4楼2015-10-17 10:12:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tolobio

新虫 (小有名气)
商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
菌落PCR用的还是比较多的，关键是比较方便。另外，质粒快抽也很方便。
如果PCR没有得到结果的话，可能的原因很多：引物问题，PCR体系问题。PCR的时候，有正负对照吗？正负对照很关键。感觉实验就是做好对照，然后就能找到问题关键，最后就是解决问题。希望有用。
需要快抽protocol的话，可以EMail我tolobio@126.com; support@tolobio.com
或者visit our website：http://www.tolobio.com/service_detail.php?id=110
赞一下 回复此楼
5楼2015-10-17 11:35:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jianguochen

新虫 (小有名气)
用这个阳参判断实验有点勉强，加入4ul线性载体的连接体系做转化比4ul的环状质粒转化效率高10倍，这个结果本身与预期是有冲突的，所以以此判断转化成功与否有待商榷。如果确实对转化结果有信心，可以将阳性提质粒，再用于PCR，或许是菌体或者质粒拷贝数比较低呢。
赞一下 回复此楼
6楼2015-10-17 22:22:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (著名写手)
本帖仅楼主可见
赞一下
7楼2015-10-18 09:02:02
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

匿名

用户注销 (著名写手)
本帖仅楼主可见
赞一下
8楼2015-10-18 09:04:31
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

啦啦啦大胖子

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Gaory0906: 金币+4, ★★★很有帮助 2015-10-21 02:56:02
1.载体4微升转化，长出来两个菌落，这本身就说明感受态的转化效率不高，一般我们1微升的载体转化进100微升感受态中，就能长一满板的菌。而你载体转化对照只能说明你感受态没有问题，不能作为连接成功的对照说明。
2.菌落PCR没有条带，有可能是你连接没有成功，也有可能是菌落PCR本身的问题，如果你确信你连接成功了，可以抽质粒再跑，或者抽质粒酶切鉴定。

PS：我之前就遇到过菌落PCR没有，但我抽质粒跑PCR，酶切，送测序都是对的。
赞一下 回复此楼
9楼2015-10-18 09:42:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Gaory0906: 金币+6, ★★★★★最佳答案 2015-10-21 02:56:12
我今年3月11号发过一篇名为“DNA重组-载体构建常见问题及解决方法”的总结，包括各个过程出现的问题、可能的原因和解决办法
1)克隆基因的酶切位点问题  
2)目的片段的扩增
3) 载体酶切的问题  
4) 连接片段浓度比的问题  
5）菌液的提取
6）酶切鉴定
7）表达鉴定包括
您可以搜一下看看，相信一定对您有很大帮助
赞一下 回复此楼
医学&统计学
10楼2015-10-18 17:59:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Gaory0906 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +36 医学老男孩 2026-08-13 85/4250 2026-08-17 21:23 by lcmdlut
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +4 基诺咪客 2026-08-17 4/200 2026-08-17 16:10 by Vivilian
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +12 Ldrop2023 2026-08-13 15/750 2026-08-17 15:02 by 小豌豆_发芽
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +8 zju2000 2026-08-16 9/450 2026-08-17 12:20 by lmz0216
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +13 archvillain 2026-08-15 25/1250 2026-08-16 20:13 by zhaosm1982
[基金申请] 2027广东省杰青 +3 奶牛小黑 2026-08-15 6/300 2026-08-16 20:07 by 奶牛小黑
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +3 Tide man 2026-08-14 3/150 2026-08-16 17:47 by jurkat.1640
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 26/1300 2026-08-16 12:35 by 启萌科技
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +10 majunge000 2026-08-11 12/600 2026-08-16 08:18 by xli1984
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[硕博家园] 读博的好处 +4 lnee 2026-08-11 4/200 2026-08-14 10:20 by ahsoarli
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭