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王希lily新虫 (初入文坛)
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SDS-PAGE图跑成这样怎么办呢？
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最近一直在做蛋白，但是跑SDS-PAGE图总是跑不好，按照刚开始认为是样品处理不好，就重新处理了几次样品，但是结果还是不理想，后来认为是配胶的液体等有问题，就全部按照书上重新配了，但是结果还是遮样，开始MARKER还能跑清楚，重新配了液后就连MARKER 条带都跑不见了。请有经验的亲们指点一下，谢谢了。 SDS-PAGE图 |
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王希lily: 金币+2 2015-10-08 10:57:03
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王希lily: 金币+2 2015-10-08 10:57:03
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重组蛋白表达纯化目的蛋白质条带模糊的相应对策 电泳凝胶浓度选择不当。 低于10Kd的小分子蛋白质要用Tricine胶。 靠近前沿的电泳带分辨率不佳。根据分子量与凝胶孔径的关系，选择适当浓度的凝胶。 蛋白质样品水解。注意除去蛋白质样品的内源性的水解酶，不要反复冻融。 电泳时间过长或过短。溴酚蓝达到分离胶的底部即应该关闭电泳电源。 缓冲溶液、SDS都要新鲜配制。 避免加样过多，提高分辨率。小体积样品可给出窄带，加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15uL（即2-10ug蛋白质）。 加热变性后的蛋白质样品要放置到室温即电泳，不要久放，因为蛋白质的二硫键在高温下可能是会断开，但是暴露于空气中温度降低会重新形成二硫键，而且可能在过久放置过程中蛋白质可能会再折叠，更不要扔到冰箱里保存。 摘自：http://www.detaibio.com/topics/sds-page-faq.html |
10楼2015-10-08 10:29:28
yangzeng1991
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2楼2015-10-07 18:40:31
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你的胶没有点样孔，是怎么点的样啊3楼2015-10-08 08:44:24
4楼2015-10-08 08:55:59
dorecnu
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王希lily: 金币+1, 有道理 2015-10-08 10:16:09
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王希lily: 金币+1, 有道理 2015-10-08 10:16:09
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第一张图不太好，第二张图尚可。 想要跑一张漂亮的SDS-PAGE图可以改进一下方面： 1. 上样前使用nano-drop或其他方法测定样品总蛋白量，使得每个孔上样量一致且在最佳蛋白量范围，图会好看很多 2. 根据目标蛋白大小选择合适浓度的SDS-PAGE凝胶,小蛋白用15%左右的凝胶,一般大小蛋白使用10-12%浓度凝胶 3. 制作凝胶时浓缩胶与分离胶比例要合适,如果是新手把握不准可以买预制胶 4. 电泳时使用小电压电泳,并使垂直电泳槽置于0-4度环境(可以使用冰盒,也可以至于4度冷柜) 5. 使用预染marker，电泳时可以实时观察marker电泳情况 6. 蛋白条带分辨率不高，可以尝试使用小孔梳子聚集蛋白，往往可以提高条带分辨率 |
5楼2015-10-08 09:10:07
王希lily
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