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Michael4ever新虫 (初入文坛)
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关于ppiczαA转化毕赤酵母GS115后表型的鉴定 已有2人参与
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| 各位大神，小弟接触毕赤酵母真核表达不久，很多东西不懂，大家都是怎么筛选mut+和muts的，ppiczαA和ppic9k不太一样，没有HIS4，一般不用md和mm筛选，我看文献里面用的是ypds培养基筛选的，我很好奇这样就能筛选出mut+么，还是得用pcr的方法鉴定表型？ |
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【答案】应助回帖
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Michael4ever: 金币+20, ★有帮助 2015-10-21 09:41:10
Michael4ever: 金币+20, ★有帮助 2015-10-21 09:41:10
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请仔细看酵母手册 Mut+和Muts：在毕赤酵母基因组中有2个醇氧化物酶编码基因，即AOX1基因和AOX2基因。菌株利用甲醇的速度主要是依靠AOX1基因表达的AOX1蛋白，其醇氧化物酶的活性非常高以至于在有AOX1 酶蛋白存在的情况下可以忽略AOX2酶蛋白，这就是甲醇营养型毕赤酵母的两种表型Mut+和Muts产生的原理。当菌株基因组中既有AOX1基因，也有AOX2基因时，菌株的表型为Mut+ 该菌株有甲醇的培养基中仍可以正常生长。当菌株基因组中仅有AOX2 因时，菌株的表型为Muts，该菌株在有甲醇的培养基中生长缓慢。 Mut+ or Muts跟你的酶切线性化方式和酵母菌株类型有关系,以GS115为例：sal1 his+mut+ sac1 his+mut+ bgl2 his+muts 文献当中就这样用zeocin抗性筛选结合他的线性化方式，已经得出了理论上的结果。要是想严谨一些的话，就再做个鉴定。 然后对于你说的：“ppiczαA和ppic9k不太一样，没有HIS4，一般不用md和mm筛选”怎么就不能用md和mm进行筛选？鉴定酵母Mut+ or Muts最普通的方法就用到了这两个培养基，跟载体是什么没关系。 |
9楼2015-10-20 10:48:11
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2楼2015-10-16 11:00:50
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3楼2015-10-16 11:01:32
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4楼2015-10-16 11:02:58
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【答案】应助回帖
| 这个很简单，ppiczαA此载体上含有zeocin抗性，YPDS是指在YPD培养基中加入了zeocin抗生素。当你导入了ppiczαA载体，就赋予了原始菌株这种抗性，这样就可以筛出mut+了 |
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5楼2015-10-16 11:08:39
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6楼2015-10-17 23:20:56
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7楼2015-10-17 23:22:17
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8楼2015-10-17 23:23:58
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谢谢你，你的回答很详细，金币也给你了，但我还是想跟你深入探讨一下，我看的文献中只要是ppiczaA和组氨酸缺陷性菌株(GS115/KM71)配合使用的时候.无一例外都没有用MM和MD筛选过表型，这就引起了我的怀疑，再加上之前有个虫友也说过“组氨酸筛选只适合带有HIS4的表达载体同你的组氨酸缺陷性菌株配套的表达系统。你用的质粒ppiczaA没有HIS4，因此组氨酸筛选不合适，因此只能用抗性筛选。培养基就没必要用MM/MMH或者MD\MDH了，用YPDSZ培养基就可以了”这是不是说明在筛选表型的时候还是得根据你用的是什么质粒？MM和MD筛选我之前也做过，但是跟理论上分析的一样，由于没有组氨酸，菌株生长非常缓慢，而且营养不良，不饱满，根本无法筛选出手册上所说的“在两种培养基上均正常生长的为HIS+Mut+(因为根本没有HIS4基因嘛。。)”我用镜检排除了长的不是毕赤酵母的可能性。不知道在MD和MM的配置过程中加入组氨酸能否正常用于该情况的下的筛选？不过感觉还是YPDSZ筛选来的简单。。 发自小木虫IOS客户端 |
10楼2015-10-21 10:12:01
