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小白鼠搞科研

新虫 (初入文坛)

[交流] 质粒构建问题，求大神帮忙看看 已有5人参与

本人构建质粒，载体是PGL3-basic,酶切位点Kpn1 ,Xho1,插入片段600bp,普通PCR条带很亮，酶切连接纯化浓度都不低，也适当提高片段浓度，涂板菌落长得很好，菌液PCR有条带很亮，但是一测序用普通PCR引物就没有信号，通用引物显示空载，双酶切检测也显示没有连上，求大神指导下到底哪里出错了。
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1楼 2015-09-19 12:59:10
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evangelina

无虫 (小有名气)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-19 22:08:49
证明菌液PCR出来的都是假阳性，可能是PCR的试剂里面混了目标片段，又或者条件没设好出来非特异条带？
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2楼2015-09-19 21:41:40
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lpuks

铜虫 (初入文坛)
★
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涂板长得很好很多不能代表确实是连接产物，涂板时做control了吗？没有的话，长得很多有可能是自连呢。还有在连接时载体可以提前做一下去磷酸化处理。“菌落PCR有条带很亮”你做菌P时用的引物是什么引物，不会是在P目的片段时的所用的primer吧，如果真是用的P目的片段时的primer，就是真P出来了，也不能说明确实连接上了，所以建议菌P时用载体上的引物。回收的时候虽然浓度不低，但是最好跑胶看一下到底有没有真回收回来。
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开心就好
3楼2015-09-19 22:50:39
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renzhiq

木虫 (小有名气)
★
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没有奖励，不太想参与讨论……

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4楼2015-09-19 23:03:51
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ppppppppp

新虫 (小有名气)
★
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据我看来，估计是xhoi的酶切效率太低了导致的…pcr产物就更难了。长出来自连的都是只切了一刀的…建议增加酶切时间，切五个小时或者过夜。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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初来乍到，请多指教
5楼2015-09-20 00:44:33
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zzhjiangnan

银虫 (小有名气)
★
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酶切效果不好，建议多切一段时间，菌P的引物是不是选的不好，无法区分空载和插入片段？
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6楼2015-09-22 18:07:21
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