应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒构建问题，求大神帮忙看看
61/1返回列表
查看: 1180  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

小白鼠搞科研

新虫 (初入文坛)

[交流] 质粒构建问题，求大神帮忙看看 已有5人参与

本人构建质粒，载体是PGL3-basic,酶切位点Kpn1 ,Xho1,插入片段600bp,普通PCR条带很亮，酶切连接纯化浓度都不低，也适当提高片段浓度，涂板菌落长得很好，菌液PCR有条带很亮，但是一测序用普通PCR引物就没有信号，通用引物显示空载，双酶切检测也显示没有连上，求大神指导下到底哪里出错了。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-09-19 12:59:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

evangelina

无虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-19 22:08:49
证明菌液PCR出来的都是假阳性，可能是PCR的试剂里面混了目标片段，又或者条件没设好出来非特异条带？
赞一下 回复此楼
2楼2015-09-19 21:41:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lpuks

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
涂板长得很好很多不能代表确实是连接产物，涂板时做control了吗？没有的话，长得很多有可能是自连呢。还有在连接时载体可以提前做一下去磷酸化处理。“菌落PCR有条带很亮”你做菌P时用的引物是什么引物，不会是在P目的片段时的所用的primer吧，如果真是用的P目的片段时的primer，就是真P出来了，也不能说明确实连接上了，所以建议菌P时用载体上的引物。回收的时候虽然浓度不低，但是最好跑胶看一下到底有没有真回收回来。
赞一下(2人) 回复此楼
开心就好
3楼2015-09-19 22:50:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

renzhiq

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
没有奖励，不太想参与讨论……

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2015-09-19 23:03:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ppppppppp

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
据我看来，估计是xhoi的酶切效率太低了导致的…pcr产物就更难了。长出来自连的都是只切了一刀的…建议增加酶切时间，切五个小时或者过夜。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
初来乍到，请多指教
5楼2015-09-20 00:44:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zzhjiangnan

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
酶切效果不好，建议多切一段时间，菌P的引物是不是选的不好，无法区分空载和插入片段？
赞一下 回复此楼
6楼2015-09-22 18:07:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 小白鼠搞科研 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 高分子化学与物理调剂 +6 好好好1233 2026-02-28 11/550 2026-03-01 17:47 by 好好好1233
[考博] 26申博 +4 想申博！ 2026-02-26 6/300 2026-03-01 17:32 by 想申博！
[考研] 化工专硕348，一志愿985求调剂 +5 弗格个 2026-02-28 8/400 2026-03-01 17:25 by sunny81
[考研] 材料类求调剂 +9 wana_kiko 2026-02-28 10/500 2026-03-01 17:01 by sunny81
[考研] 285求调剂 +8 满头大汗的学生 2026-02-28 8/400 2026-03-01 16:47 by caszguilin
[考研] 材料化工调剂 +9 今夏不夏 2026-03-01 10/500 2026-03-01 16:01 by hmn_wj
[考研] 0856调剂 +4 刘梦微 2026-02-28 4/200 2026-03-01 15:35 by 吸一口猫气
[考研] 304求调剂 +6 曼殊2266 2026-02-28 7/350 2026-03-01 15:14 by wjLi2017
[考研] 材料工程274求调剂 +3 Lilithan 2026-03-01 3/150 2026-03-01 14:58 by ms629
[考研] 303求调剂 +4 今夏不夏 2026-03-01 4/200 2026-03-01 14:46 by 嘟嘟小浣熊
[考研] 求调剂 +6 repeatt?t 2026-02-28 6/300 2026-03-01 14:37 by Sakura绘
[考研] 一志愿中南大学理学化学 +3 15779376950 2026-03-01 4/200 2026-03-01 14:27 by 15779376950
[考研] 298求调剂 +9 人间唯你是清欢 2026-02-28 12/600 2026-03-01 14:23 by Ducount.Y
[考研] 284求调剂 +6 天下熯 2026-02-28 6/300 2026-03-01 14:19 by Ducount.Y
[考研] 化工299分求调剂 一志愿985落榜 +4 嘻嘻(*^ω^*) 2026-03-01 4/200 2026-03-01 13:15 by wang_dand
[考研] 306分材料调剂 +3 chuanzhu川烛 2026-03-01 4/200 2026-03-01 12:32 by houyaoxu
[考研] 调剂 +3 简木ChuFront 2026-02-28 3/150 2026-03-01 11:46 by 王伟要上岸啊
[考研] 311求调剂 +9 南迦720 2026-02-28 10/500 2026-03-01 10:55 by sunny81
[考研] 272求调剂 +4 田智友 2026-02-28 4/200 2026-03-01 06:43 by 刘兵
[高分子] 求环氧树脂研发1名 +3 孙xc 2026-02-25 11/550 2026-02-28 16:57 by ichall
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭