应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒构建问题，求大神帮忙看看
61/1返回列表
查看: 1391  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

小白鼠搞科研

新虫 (初入文坛)

[交流] 质粒构建问题，求大神帮忙看看 已有5人参与

本人构建质粒，载体是PGL3-basic,酶切位点Kpn1 ,Xho1,插入片段600bp,普通PCR条带很亮，酶切连接纯化浓度都不低，也适当提高片段浓度，涂板菌落长得很好，菌液PCR有条带很亮，但是一测序用普通PCR引物就没有信号，通用引物显示空载，双酶切检测也显示没有连上，求大神指导下到底哪里出错了。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-09-19 12:59:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

evangelina

无虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-19 22:08:49
证明菌液PCR出来的都是假阳性，可能是PCR的试剂里面混了目标片段，又或者条件没设好出来非特异条带？
赞一下 回复此楼
2楼2015-09-19 21:41:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lpuks

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
涂板长得很好很多不能代表确实是连接产物，涂板时做control了吗？没有的话，长得很多有可能是自连呢。还有在连接时载体可以提前做一下去磷酸化处理。“菌落PCR有条带很亮”你做菌P时用的引物是什么引物，不会是在P目的片段时的所用的primer吧，如果真是用的P目的片段时的primer，就是真P出来了，也不能说明确实连接上了，所以建议菌P时用载体上的引物。回收的时候虽然浓度不低，但是最好跑胶看一下到底有没有真回收回来。
赞一下(2人) 回复此楼
开心就好
3楼2015-09-19 22:50:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

renzhiq

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
没有奖励，不太想参与讨论……

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2015-09-19 23:03:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ppppppppp

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
据我看来，估计是xhoi的酶切效率太低了导致的…pcr产物就更难了。长出来自连的都是只切了一刀的…建议增加酶切时间，切五个小时或者过夜。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
初来乍到，请多指教
5楼2015-09-20 00:44:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zzhjiangnan

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
酶切效果不好，建议多切一段时间，菌P的引物是不是选的不好，无法区分空载和插入片段？
赞一下 回复此楼
6楼2015-09-22 18:07:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 小白鼠搞科研 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 YXM1FDCSE8Bn 2026-10-31 6/300 2026-11-02 12:51 by n0P4fnsXKbBK
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 YXM1FDCSE8Bn 2026-10-31 6/300 2026-11-02 12:44 by n0P4fnsXKbBK
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 BCdvBAEpt3zm 2026-11-01 4/200 2026-11-02 10:23 by dcc2yOIRGGTT
[找工作] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 YXM1FDCSE8Bn 2026-11-01 6/300 2026-11-02 10:02 by dcc2yOIRGGTT
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 hKe7U1kad5Sg 2026-10-31 7/350 2026-11-02 09:29 by dcc2yOIRGGTT
[基金申请] 各位基础老师们，看完中央《从严治党》的决定后，对学术界更加有信心了吧 +3 iaeyuan 2026-11-01 3/150 2026-11-02 07:49 by kudofaye
[硕博家园] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 hKe7U1kad5Sg 2026-10-31 7/350 2026-11-02 06:29 by xzcv0Tehd8lQ
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 8/400 2026-11-02 06:07 by xzcv0Tehd8lQ
[考研] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +5 xvJS1BYDxvBS 2026-10-31 13/650 2026-11-02 06:03 by xzcv0Tehd8lQ
[论文投稿] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 14/700 2026-11-02 05:41 by xzcv0Tehd8lQ
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 21/1050 2026-11-02 05:41 by xzcv0Tehd8lQ
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 hKe7U1kad5Sg 2026-10-31 5/250 2026-11-02 03:39 by xzcv0Tehd8lQ
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 hKe7U1kad5Sg 2026-10-31 9/450 2026-11-02 03:26 by xzcv0Tehd8lQ
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 hKe7U1kad5Sg 2026-10-31 6/300 2026-11-01 22:11 by xzcv0Tehd8lQ
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 1uaZt2kAZj2S 2026-10-31 8/400 2026-11-01 14:48 by BCdvBAEpt3zm
[硕博家园] 越来越担心硕士毕业后没有竞争力了 +9 zuesli 2026-10-27 15/750 2026-11-01 12:59 by Equinoxhua
[考博] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 1uaZt2kAZj2S 2026-10-30 10/500 2026-11-01 12:27 by BCdvBAEpt3zm
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 X5bHxOULxFqb 2026-10-30 18/900 2026-11-01 12:11 by BCdvBAEpt3zm
[考博] 2027博士申请-临床检验诊断学、病原生物学、微生物方向 50+3 yyh@ 2026-10-28 4/200 2026-10-31 12:47 by 可淡不可忘
[硕博家园] 申博自荐 2篇一区TOP+1篇EI+2公开发明专利 2027博士申请 +3 小小阿光 2026-10-27 3/150 2026-10-29 23:56 by 起风了的快乐
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭