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小白鼠搞科研

新虫 (初入文坛)

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[交流] 质粒构建问题，求大神帮忙看看已有5人参与

本人构建质粒，载体是PGL3-basic,酶切位点Kpn1 ,Xho1,插入片段600bp,普通PCR条带很亮，酶切连接纯化浓度都不低，也适当提高片段浓度，涂板菌落长得很好，菌液PCR有条带很亮，但是一测序用普通PCR引物就没有信号，通用引物显示空载，双酶切检测也显示没有连上，求大神指导下到底哪里出错了。

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PGEX-6P-1 载体构建求帮忙已经有10人回复

1楼 2015-09-19 12:59:10

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evangelina

无虫 (小有名气)

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-19 22:08:49

证明菌液PCR出来的都是假阳性，可能是PCR的试剂里面混了目标片段，又或者条件没设好出来非特异条带？

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2楼2015-09-19 21:41:40

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lpuks

铜虫 (初入文坛)

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专业: 细胞信号转导

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涂板长得很好很多不能代表确实是连接产物，涂板时做control了吗？没有的话，长得很多有可能是自连呢。还有在连接时载体可以提前做一下去磷酸化处理。“菌落PCR有条带很亮”你做菌P时用的引物是什么引物，不会是在P目的片段时的所用的primer吧，如果真是用的P目的片段时的primer，就是真P出来了，也不能说明确实连接上了，所以建议菌P时用载体上的引物。回收的时候虽然浓度不低，但是最好跑胶看一下到底有没有真回收回来。

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