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娃娃鲵

新虫 (初入文坛)

[求助] 2500bp左右基因很难与载体连接 已有10人参与

最近在做一个2500bp左右的基因克隆,菌液pcr某些是有看到目的条带,但最后双酶切鉴定的时候一个目的条带都没看到。
载体是5000多bp
是不是片段太大了很难连接上
怎么改进呢?
用的是T4连接酶。
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
从技术角度来讲,将2500bp左右的片段往5000bp的载体上连,难度不大,能否详述你的实验过程:
1. 用的什么限制性内切酶?
2. 用的什么感受态以及效率如何?
3. 片段和载体你时如何做酶切的?
4. 你时如何做连接的?
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2015-09-04 05:04:00
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普通回帖

976592787

木虫 (正式写手)

国家自然科学基金委员会委员长

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你这让人怎么回答好呢?多从实验操作和个人技术层面找原因吧。目前我做的基因长度在3500bp,载体9200多bp,如果因为片段太大那构建难度得多大,那我还不如放弃吧

发自小木虫Android客户端
耻与众草之为伍,何亭亭而独芳!何不为人之所赏兮,深山穷谷委严霜。
2楼2015-09-04 00:05:11
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yangxp2006

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
2.5k片段算正常的长度了,很好弄,我最长构建过7kb基因的载体。以我的经验,失败主要考虑以下几个原因:
1、目的基因pcr产物浓度不能太低
2、目的基因pcr产物和载体酶切完全,






以及回收后浓度不能太低,至少应该电泳能看到条带…
3、目的基因和载体连接时比例要合适,一般来说都是目标片段多,大概1:1~5:1都可以。
4、感受态转化效率不能太低
5、鉴定时应该用载体引物和目的片段上引物鉴定,避免假阳性…

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
4楼2015-09-05 23:52:40
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yangxp2006

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

2.5k片段算正常的长度了,很好弄,我最长构建过7kb基因的载体。以我的经验,失败主要考虑以下几个原因:
1、目的基因pcr产物浓度不能太低
2、目的基因pcr产物和载体酶切完全,
以及回收后浓度不能太低,至少应该电泳能看到条带…
3、目的基因和载体连接时比例要合适,一般来说都是目标片段多,大概1:1~5:1都可以。
4、感受态转化效率不能太低
5、鉴定时应该用载体引物和目的片段上引物鉴定,避免假阳性…

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
5楼2015-09-05 23:53:59
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dehong1573

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
2.5k不算大的,如果PCR条带很明显的话应该问题不大的,可以用载体上面的引物扩增,以避免假阳性,酶切的酶条带,酶切前跑胶了没,条带怎么样,如果酶切前有条带,显然是酶切的原因了,从酶切找问题吧
科学永无止境,只有合作共享才能更好地……
6楼2015-09-06 08:01:18
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穿白大褂约会

禁言 (小有名气)

感谢参与,应助指数 +1
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7楼2015-09-06 16:11:47
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a314919473

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
换个连接试剂盒,国产的 全式金,进口的  Thermo  都挺不错的,简单又高效
有你真好
8楼2015-09-06 16:30:09
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怜儿新

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

做酶切前提取的质粒量怎么样,如果太少,酶切不出来的,而pcr是可以的,极微量都可以。
朝梦想奔跑
9楼2015-09-14 21:55:59
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jeff瓜瓜

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

其实长度不算长,首先,确保质粒确实被切开了,跑个胶看看,再者保证连接时质粒和片段的浓度,其实转化的感受态什么的都不是主要的问题,如果实在不行,可以试试infusion;golden gate等比较高效的方法
10楼2015-09-14 22:23:06
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