24小时热门版块排行榜    

北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
查看: 3502  |  回复: 12
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

娃娃鲵

新虫 (初入文坛)

[求助] 2500bp左右基因很难与载体连接 已有10人参与

最近在做一个2500bp左右的基因克隆,菌液pcr某些是有看到目的条带,但最后双酶切鉴定的时候一个目的条带都没看到。
载体是5000多bp
是不是片段太大了很难连接上
怎么改进呢?
用的是T4连接酶。
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

穿白大褂约会

禁言 (小有名气)

感谢参与,应助指数 +1
本帖内容被屏蔽

7楼2015-09-06 16:11:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 13 个回答

976592787

木虫 (正式写手)

国家自然科学基金委员会委员长

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你这让人怎么回答好呢?多从实验操作和个人技术层面找原因吧。目前我做的基因长度在3500bp,载体9200多bp,如果因为片段太大那构建难度得多大,那我还不如放弃吧

发自小木虫Android客户端
耻与众草之为伍,何亭亭而独芳!何不为人之所赏兮,深山穷谷委严霜。
2楼2015-09-04 00:05:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
从技术角度来讲,将2500bp左右的片段往5000bp的载体上连,难度不大,能否详述你的实验过程:
1. 用的什么限制性内切酶?
2. 用的什么感受态以及效率如何?
3. 片段和载体你时如何做酶切的?
4. 你时如何做连接的?
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2015-09-04 05:04:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yangxp2006

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
2.5k片段算正常的长度了,很好弄,我最长构建过7kb基因的载体。以我的经验,失败主要考虑以下几个原因:
1、目的基因pcr产物浓度不能太低
2、目的基因pcr产物和载体酶切完全,






以及回收后浓度不能太低,至少应该电泳能看到条带…
3、目的基因和载体连接时比例要合适,一般来说都是目标片段多,大概1:1~5:1都可以。
4、感受态转化效率不能太低
5、鉴定时应该用载体引物和目的片段上引物鉴定,避免假阳性…

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
4楼2015-09-05 23:52:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 366求调剂 +7 sbdnd 2026-04-03 7/350 2026-04-03 12:40 by cymywx
[考研] 材料调剂 +13 一样YWY 2026-04-02 13/650 2026-04-03 12:16 by xingguangj
[考研] 求材料调剂,一志愿郑州大学289分 +13 硕星赴 2026-04-03 13/650 2026-04-03 11:41 by 纯净水2025
[考研] 求调剂 +3 心想事成可 2026-04-03 3/150 2026-04-03 11:22 by wangjy2002
[考研] 材料与化工306分找调剂 +10 沧海轻舟e 2026-04-03 11/550 2026-04-03 11:07 by 啵啵啵0119
[考研] 专硕 351 086100 也是考的材科基 本科也是材料 +8 202451007219 2026-04-02 8/400 2026-04-03 09:50 by 蓝云思雨
[考研] 一志愿南开大学0710生物学359求调剂 +6 兔兔兔111223314 2026-03-29 8/400 2026-04-02 22:37 by louise0220
[考研] 310求调剂 +17 争取九点睡 2026-03-30 17/850 2026-04-02 16:40 by guanxin1001
[考研] 085600,材料与化工321分求调剂 +11 大馋小子 2026-03-28 11/550 2026-04-02 15:59 by yunlongyang
[考研] 318求调剂 +3 笃行致远. 2026-03-31 4/200 2026-04-02 15:56 by Jaylen.
[考研] 311求调剂 +16 zchqwer 2026-04-01 18/900 2026-04-02 10:15 by 不吃魚的貓
[考研] 291求调剂 +20 Y-cap 2026-03-29 25/1250 2026-04-01 23:49 by 欣喜777
[考研] 339求调剂,想调回江苏 +7 烤麦芽 2026-03-27 10/500 2026-04-01 21:35 by 495374996
[考研] 材料与化工(0856)304求B区调剂 +8 邱gl 2026-03-30 16/800 2026-04-01 17:58 by 邱gl
[考研] 0856调剂 +7 曲听筠 2026-03-30 7/350 2026-04-01 08:51 by JourneyLucky
[考研] 318求调剂 +10 陈晨79 2026-03-30 10/500 2026-03-31 17:37 by 544594351
[考研] 262求调剂 +7 ZZ..000 2026-03-30 8/400 2026-03-31 10:05 by cal0306
[考研] 一志愿中海洋320化学工程与技术学硕求调剂 +8 披星河 2026-03-30 8/400 2026-03-31 08:53 by lbsjt
[考研] 327求调剂 +5 小卡不卡. 2026-03-29 5/250 2026-03-30 19:30 by Wang200018
[考研] 291求调剂 +5 Y-cap 2026-03-29 6/300 2026-03-29 13:18 by mumin1990
信息提示
请填处理意见