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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 2500bp左右基因很难与载体连接
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娃娃鲵

新虫 (初入文坛)

[求助] 2500bp左右基因很难与载体连接 已有10人参与

最近在做一个2500bp左右的基因克隆，菌液pcr某些是有看到目的条带，但最后双酶切鉴定的时候一个目的条带都没看到。
载体是5000多bp
是不是片段太大了很难连接上
怎么改进呢？
用的是T4连接酶。
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1楼 2015-09-03 23:19:27
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
从技术角度来讲，将2500bp左右的片段往5000bp的载体上连，难度不大，能否详述你的实验过程：
1. 用的什么限制性内切酶？
2. 用的什么感受态以及效率如何？
3. 片段和载体你时如何做酶切的？
4. 你时如何做连接的？
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2015-09-04 05:04:00
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普通回帖

976592787

木虫 (正式写手)

国家自然科学基金委员会委员长

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这让人怎么回答好呢？多从实验操作和个人技术层面找原因吧。目前我做的基因长度在3500bp，载体9200多bp，如果因为片段太大那构建难度得多大，那我还不如放弃吧

发自小木虫Android客户端
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耻与众草之为伍，何亭亭而独芳！何不为人之所赏兮，深山穷谷委严霜。
2楼2015-09-04 00:05:11
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yangxp2006

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
2.5k片段算正常的长度了，很好弄，我最长构建过7kb基因的载体。以我的经验，失败主要考虑以下几个原因：
1、目的基因pcr产物浓度不能太低
2、目的基因pcr产物和载体酶切完全，






以及回收后浓度不能太低，至少应该电泳能看到条带…
3、目的基因和载体连接时比例要合适，一般来说都是目标片段多，大概1：1～5：1都可以。
4、感受态转化效率不能太低
5、鉴定时应该用载体引物和目的片段上引物鉴定，避免假阳性…

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2015-09-05 23:52:40
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yangxp2006

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

2.5k片段算正常的长度了，很好弄，我最长构建过7kb基因的载体。以我的经验，失败主要考虑以下几个原因：
1、目的基因pcr产物浓度不能太低
2、目的基因pcr产物和载体酶切完全，
以及回收后浓度不能太低，至少应该电泳能看到条带…
3、目的基因和载体连接时比例要合适，一般来说都是目标片段多，大概1：1～5：1都可以。
4、感受态转化效率不能太低
5、鉴定时应该用载体引物和目的片段上引物鉴定，避免假阳性…

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5楼2015-09-05 23:53:59
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dehong1573

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
2.5k不算大的，如果PCR条带很明显的话应该问题不大的，可以用载体上面的引物扩增，以避免假阳性，酶切的酶条带，酶切前跑胶了没，条带怎么样，如果酶切前有条带，显然是酶切的原因了，从酶切找问题吧
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科学永无止境,只有合作共享才能更好地……
6楼2015-09-06 08:01:18
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穿白大褂约会

禁言 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
7楼2015-09-06 16:11:47
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a314919473

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
换个连接试剂盒，国产的 全式金，进口的  Thermo  都挺不错的，简单又高效
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有你真好
8楼2015-09-06 16:30:09
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怜儿新

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

做酶切前提取的质粒量怎么样，如果太少，酶切不出来的，而pcr是可以的，极微量都可以。
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朝梦想奔跑
9楼2015-09-14 21:55:59
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jeff瓜瓜

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

其实长度不算长，首先，确保质粒确实被切开了，跑个胶看看，再者保证连接时质粒和片段的浓度，其实转化的感受态什么的都不是主要的问题，如果实在不行，可以试试infusion；golden gate等比较高效的方法
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10楼2015-09-14 22:23:06
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