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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 【新手求助】RNA纯度低对接下来反转录、real-time PCR影响大吗？有什么补救方法吗？
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zjy000999

新虫 (初入文坛)

[求助] 【新手求助】RNA纯度低对接下来反转录、real-time PCR影响大吗？有什么补救方法吗？ 已有1人参与

细胞沉淀用TRIZol法提的，目的是看一下瞬转是否成功效率如何。纯度不高，A260/280分别为1.44、1.65、1.67、1.94。下一步计划是做反转录，real-time PCR，不需要很精确，只想大概知道转染成功与否。请问这样影响大吗？或者有什么补救的方法，因为重提涉及很多麻烦的东西。谢谢大神指导！

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1楼 2015-08-25 23:51:56
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ljq1027

金虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by zjy000999 at 2015-08-26 10:18:09
我继续之前实验，引物都是师兄设计好的~只想知道这种纯度能否做反转录
...

你们使用特异引物进行第一链合成啊？其实还是推荐你重新提。如果继续做的话其实没有必要做qPCR，做个普通PCR看有没有就可以了。
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无可奈何花落去，似曾相识燕归来~
9楼2015-08-26 10:27:36
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ljq1027

金虫 (小有名气)
如果转染的基因和细胞不是同一个种属的话，这个可以用来确定转染是否成功。但是要确定效率的话，涉及到定量了，只能重提RNA了。
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无可奈何花落去，似曾相识燕归来~
2楼2015-08-26 00:34:29
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ljq1027

金虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by zjy000999 at 2015-08-26 06:35:23
多谢回答！补充一下，转的是MiRNA，只想初步地定性地看一下转染是否成功，不需要定量效率~这种情况呢？
...

如果转的是miRNA，当时为什么不用偶联荧光基团的RNA确定是否能转染成功呢。而且你做qPCR想P的是作用的目标基因？
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无可奈何花落去，似曾相识燕归来~
5楼2015-08-26 09:17:19
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ljq1027

金虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by zjy000999 at 2015-08-26 09:39:19
买的公司出的mimic和inhibitor，想p一下miRNA
...

我不做miRNA，但是它们都这么短，你用什么引物逆转录呢？
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无可奈何花落去，似曾相识燕归来~
7楼2015-08-26 10:08:50
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zjy000999

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by ljq1027 at 2015-08-26 00:34:29
如果转染的基因和细胞不是同一个种属的话，这个可以用来确定转染是否成功。但是要确定效率的话，涉及到定量了，只能重提RNA了。

转的是mirna呢？

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3楼2015-08-26 06:23:17
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zjy000999

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by ljq1027 at 2015-08-26 00:34:29
如果转染的基因和细胞不是同一个种属的话，这个可以用来确定转染是否成功。但是要确定效率的话，涉及到定量了，只能重提RNA了。

多谢回答！补充一下，转的是MiRNA，只想初步地定性地看一下转染是否成功，不需要定量效率~这种情况呢？

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4楼2015-08-26 06:35:23
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zjy000999

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5楼: Originally posted by ljq1027 at 2015-08-26 09:17:19
如果转的是miRNA，当时为什么不用偶联荧光基团的RNA确定是否能转染成功呢。而且你做qPCR想P的是作用的目标基因？...

买的公司出的mimic和inhibitor，想p一下miRNA

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6楼2015-08-26 09:39:19
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zjy000999

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7楼: Originally posted by ljq1027 at 2015-08-26 10:08:50
我不做miRNA，但是它们都这么短，你用什么引物逆转录呢？...

我继续之前实验，引物都是师兄设计好的~只想知道这种纯度能否做反转录

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8楼2015-08-26 10:18:09
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zjy000999

新虫 (初入文坛)
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9楼: Originally posted by ljq1027 at 2015-08-26 10:27:36
你们使用特异引物进行第一链合成啊？其实还是推荐你重新提。如果继续做的话其实没有必要做qPCR，做个普通PCR看有没有就可以了。...

谢谢！普通pcr对纯度要求不高是吗？

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10楼2015-08-26 10:50:49
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