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alsaith

新虫 (初入文坛)

[求助] 做 western blot 的 GAPDH 内参,总有杂带 已有2人参与

已经做了一个多月的 GAPDH 内参,总是有杂带,我用的是 bioworlde 品牌的一抗,说明书上建议的浓度是 1:5000—1:15000。我第一次做的时候是用 1:5000,结果是有明显的杂带,而且杂带和我要的条带矮得很近;第二次做是 1:7000,杂带明显且与所要条带距离很近;第三次,重新配置一抗,换了一组样,其他条件和前两次一样,条带表带效果不好,但是杂带没有了;从第四次开始,次次出现杂带,而且第四次我的样品和方法与第三次相同。我试了很多方法,比如说增加浓缩胶、加大封闭时间、用封闭液配置一抗,单仍然有杂带......求助各位大神,怎样才能解决,我今年研一刚结束,刚做了一年western,望帮助QAQ
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alsaith

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2015-08-27 09:01:07
抗体特异性差什么招都没用。
换抗体吧,去隔壁的实验室问问他们的内参抗体是哪里买的
买已经和HRP偶联的GAPDH抗体,稍微好点,还省得用二抗。

我也准备去借一点儿先试试,是不是抗体的问题QAQ,谢谢~

发自小木虫Android客户端
5楼2015-08-27 15:25:20
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haihang528

铁虫 (初入文坛)

是下面有条浅浅的条带吗?如果是应该问题不大。。我的每次都有,而且和主条带的深浅趋势一致,恰好可以做个参考。。。
生物工程制药方向的有志青年。。
2楼2015-08-25 23:54:39
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alsaith

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by haihang528 at 2015-08-25 23:54:39
是下面有条浅浅的条带吗?如果是应该问题不大。。我的每次都有,而且和主条带的深浅趋势一致,恰好可以做个参考。。。

和主条带分不开,有重叠部分,而且关键是,它颜色也不浅QAQ,发愁ing

发自小木虫Android客户端
3楼2015-08-26 13:46:29
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲,勿施于人

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
抗体特异性差什么招都没用。
换抗体吧,去隔壁的实验室问问他们的内参抗体是哪里买的
买已经和HRP偶联的GAPDH抗体,稍微好点,还省得用二抗。
The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
4楼2015-08-27 09:01:07
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