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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助！HRM PCR基因分型问题
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xrxleisure

铜虫 (正式写手)

[求助] 求助！HRM PCR基因分型问题 已有1人参与

最近在做HRM PCR基因分型，但在PCR扩增的过程中出现了各种问题，有做过HRM PCR的吗，能否交流一下经验？在此不胜感激！
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1楼 2015-08-21 15:05:49
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xrxleisure

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 许彦 at 2015-08-24 10:01:24
首先你用的什么pcr仪器，
同一个样本重复差异有很多，但是tm值应该是不会有变化的。

用的是Rotor-Gene Q PCR仪，因为做的样本量较大，做了野生型，纯合型，杂合型的质粒分别做了两组，同样都是野生型的两个曲线，两个相比，其中一个明显滞后了，两组质粒相比的话，另一组质粒的扩增曲线都滞后于第一组，不清楚跟放置孔的位置有关还是怎么回事。我之前做的比较基因表达量的荧光PCR的时候，每个样品都是做三个重复的，而做HRM PCR的时候，我们公司都不做重复，我觉得不是很好，刚开始做HRM PCR很多都不太懂。结果不是太好也找不到原因，能够得到您的帮助非常的感谢。
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5楼2015-08-25 08:45:44
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ptttmt

银虫 (正式写手)
具体说说都出现了啥情况

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2楼2015-08-21 15:31:32
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xrxleisure

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ptttmt at 2015-08-21 15:31:32
具体说说都出现了啥情况

就是质粒做的两个重复，重复样本间的差异很大，还有就是相同的基因位点，不同的样本，扩增曲线差异也很大，有时候扩增的曲线很不好，PCR条件都是相同的，PCR仪也是同一台，刚接触HRM PCR，很多操作过程可能都不是很规范，能不能细讲一下。谢谢了！
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3楼2015-08-24 08:33:39
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许彦

木虫 (正式写手)
首先你用的什么pcr仪器，
同一个样本重复差异有很多，但是tm值应该是不会有变化的。

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4楼2015-08-24 10:01:24
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sxfldn

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

稀释的浓度一样吗？无模板对照有扩增吗？
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6楼2015-08-25 09:19:44
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xrxleisure

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by sxfldn at 2015-08-25 09:19:44
稀释的浓度一样吗？无模板对照有扩增吗？

质粒稀释的浓度都是一样的，样品DNA模板的浓度大致差别也不大都在60-70ng/uL的范围，无模板的对照没有扩增，我觉得应该没有污染。但是做出来的结果不好，有些就做不出分型，我该开始接触HRM　PCR，很多都不太懂，谢谢您的帮助。出现这样的结果也找不到原因，很是困惑。
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7楼2015-08-25 09:34:37
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许彦

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xrxleisure at 2015-08-25 08:45:44
用的是Rotor-Gene Q PCR仪，因为做的样本量较大，做了野生型，纯合型，杂合型的质粒分别做了两组，同样都是野生型的两个曲线，两个相比，其中一个明显滞后了，两组质粒相比的话，另一组质粒的扩增曲线都滞后于第一 ...

那你做的hrm有区别吗？ct值大概查多少，有没有试试换不同的孔做做，有没有做提取一个核酸的重复（有没有复孔）

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8楼2015-08-25 10:50:57
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xrxleisure

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 许彦 at 2015-08-25 10:50:57
那你做的hrm有区别吗？ct值大概查多少，有没有试试换不同的孔做做，有没有做提取一个核酸的重复（有没有复孔）
...

有差别啊，差别还挺大，ct值大约都在25左右，没有做复孔，就质粒做了两次重复，结果不太好，能不能详细的给我说一下你们都是怎样做HRM PCR的，每个样本都做重复吗？
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9楼2015-08-25 11:25:21
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许彦

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by xrxleisure at 2015-08-25 11:25:21
有差别啊，差别还挺大，ct值大约都在25左右，没有做复孔，就质粒做了两次重复，结果不太好，能不能详细的给我说一下你们都是怎样做HRM PCR的，每个样本都做重复吗？...

如果刚开始做的话，首先是得发现问题，找原因。我一般也不做复孔，我建议你做是想看看你是不是存在加样误差。会不会有提取问题

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10楼2015-08-25 11:52:46
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