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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 双酶切及测序问题
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hanyu426980

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切及测序问题 已有2人参与

本人使用PETDuet-1双表达载体连入两个目的基因，两个基因已经连进去，其中一个经测序结果正确，另外一个上游选用BamH I酶切位点，下游选用SalI酶切位点，载体上BamHI在SalI酶切位点前面，但是连接后测序结果出现SalI在前而且目的基因序列反向互补。
   本应该是 BamH I-目的基因-SalI，但现在是SalI-目的基因反向互补-BamHI这样的顺序连入载体，不知是何原因，求大神解答。
  注：不是测序上下游问题，已经和载体序列比对过，真的是反向互补连进去的，且酶切位点不同也连进去了，载体序列之前也测序过，是正确的。
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1楼 2015-08-15 13:28:18
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hanyu426980

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 曼陀罗的祈祷 at 2015-09-07 15:01:29
petduet-1在哪里买的，求助

上海吉然
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6楼2015-09-09 10:48:12
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sky0328

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

想知道你的第2个片段是如何加入的酶切位点，如果是引物两段加入的，是否当时把上下游引物的酶切位点加反了？
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3楼2015-08-22 13:44:28
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hanyu426980

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by sky0328 at 2015-08-22 13:44:28
想知道你的第2个片段是如何加入的酶切位点，如果是引物两段加入的，是否当时把上下游引物的酶切位点加反了？

引物两端加入的，送去合成的引物序列酶切位点不是反的，合成应该不会出现这种问题。比如我上游BamHI酶切位点确实是连在基因的上游，但是载体上BamHI虽然是在SalI前面，但是却连在了SalI该在的位置。分子这东西真是搞不懂，什么奇怪的事都能出现。
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4楼2015-08-24 11:04:43
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

petduet-1在哪里买的，求助
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想做个有趣的人，却在逗比的道路上越走越远~
5楼2015-09-07 15:01:29
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